СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ БАКТЕРИЙ PASTEURELLA MULTOCIDA Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть применено в целях стандартизации контрольно-производственных штаммов пастерелл, а также при диагностике и эпизоотологии пастереллеза птиц.

Известно, что возбудители пастереллезов, в частности бактерии Pasteurella multocida, вариабильны по патогенности и вирулентности (И.В. Домарадский, 1971). Экспериментально доказано, что пастереллы снижают вирулентность при пассажах через слабовосприимчивый организм (И.Я. Глебова, 1958). Считают, что отличающиеся по вирулентности пастереллы происходят в результате спонтанных пассажей на разных видах млекопитающих и птиц, отличающихся восприимчивостью к заражению (P.E. Curtis et al., 1980; М.А. Сидоров, Э.М. Агаева, 1982). В биопробе при диагностике пастереллеза птиц применяют в качестве наиболее восприимчивых лабораторных биомоделей голубей, белых мышей, эмбрионы кур (Н. М. Никифорова, 1962, 1971). Однако у пастерелл при пассажах даже и на высоковосприимчивых организмах вирулентность может снижаться (J.B. Uichanco et al. , 1952). Более того, в эпизоотических очагах пастереллеза птиц бывает, что микроорганизм спонтанно утрачивает вирулентность и болезнь переходит в бактерионосительство (Е.М. Кожевников, 1971, 1973, 1974). Появление же вирулентных пастерелл, вызывающих энзоотии, происходит при определенных метеоусловиях (резкие похолодания, дожди, высокая влажность воздуха) и в связи с бактерионосительством (Г.Л. Пустовит, 1965; Н.Г. Сердюк, 1969).

Принято считать, что утрата или восстановление вирулентности и одновременно капсулы (капсульного антигена) связано с диссоциацией пастерелл (G.R. Carter, 1955, 1957, 1958, 1972). При этом капсулу выделяют как фактор патогенности (И. В. Домарадский, 1971) и наиболее иммуногенную часть микробной клетки (А. Н. Борисенкова, 1979). В результате собственных исследований установлено, что при пероральном заражении птиц пастереллы инкапсулируют одновременно с развитием биполярности, что происходит в трупах на протяжении 3 посмертных часов. При этом замечено, что пастереллы, изолированные из одного и того же трупа птицы в разные посмертные часы, отличаются по вирулентности и, как правило, наиболее активны через 3 посмертных часа, то есть в момент выраженной инкапсуляции и биполярности. Причем это происходит при постепенном остывании трупа до полного окоченения.

Есть данные о влиянии температуры и питательной среды на биологическую активность пастерелл. Например, при 16-17^oC пастереллы сохраняют вегетативные и вирулентные свойства, а при 2-4^oC теряют жизнеспособность в течение года (Norberg, Buenc, 1950. Цит. по Никифоровой Н.М. "Болезни птиц", М., 1962, с. 309). В патологическом материале от птиц (в мясе), замороженном при -14...-16^oC. пастереллы сохраняют биологическую активность в течение года, в замороженной же бульонной культуре они через 3 месяца хранения уже не жизнеспособны (Е.М. Кожевников, Н.М. Дмитриева, 1966).

Известно, что пастереллы пассируют на белых мышах, печень которых замораживают с целью температурного консервирования штаммов бактерий (E.D. Fuentes, M. Qintama, 1984). Однако в лабораторной практике этот метод недостаточно удобен и не представляет возможности получать и сохранять штаммы пастерелл в наиболее активном состоянии.

Известно, что в целях активизации пастерелл при их идентификации предложено заражать лабораторных животных (белых мышей, морских свинок, кроликов, голубей) одновременно тремя способами (через дыхательные пути, внутрибрюшинно, подкожно) и от павших соответственно выделять бактерии из места введения культуры (В.Л. Семиотрочев, В.М. Степанов, И.Л. Мартиневский, Л.С. Безрукова, 1985). Однако без учета условий постановки биопробы на макроорганизмах и в результате спонтанного отбора патологического материала из трупов для выделения штаммов бактерий достигнуть максимальной активизации возбудителя пастереллеза так не представляется возможным.

Известен общепринятый способ активизации пастерелл в биопробе, включающий заражение восприимчивых организмов (обычно по источнику происхождения бактерий) и выделение культур микроба из трупов, применяемый, например, при стандартизации контрольно-производственных штаммов с учетом их лиофилизации ("Вет. препараты", М. , 1981, с. 238) - прототип. Существенным недостатком этого способа является неполная активизация пастерелл по причине неточных условий постановки биопробы на восприимчивых организмах и спонтанного отбора патологического материала из трупов для выделения штаммов бактерий.

Задачей изобретения является достижение максимальной активизации пастерелл путем повышения точности условий постановки биопробы на птицах и выделения бактерий из трупов.

Поставленная задача достигается тем, что заражение производят пробой инфицированной крови, отобранной через 3-4 посмертных часа из сердца павшей в результате перорального заражения птицы, остывшей с момента летальности при 15-25^oC, путем нанесения на слизистую оболочку небной щели интактной птице, которую сразу же помещают в условия при 0-10^oC, а с момента агонии - при 15-25^oC, выделение же пастерелл, причем выраженно инкапсулированных и высоковирулентных, выполняют через 3-4 посмертных часа, изолируя бактерии из крови сердца трупа.

Существенным отличием является то, что из сердца павшей в результате перорального заражения птицы, остывшей с момента летальности при 15-25^oC, через 3-4 посмертных часа берут пробу инфицированной крови и наносят на слизистую оболочку небной щели интактной птице, которую сразу же помещают в условия при 0-10^oC, а с момента агонии - при 15-25^oC, и через 3-4 посмертных часа изолируют из крови сердца выраженно инкапсулированные высоковирулентные пастереллы. При таких условиях постановки биопробы пастереллы полностью утрачивают капсулу, биполярность, оформляются в малые по величине коккоподобные бактерии, проходят защитные барьеры организма и в результате выраженной септицемии быстро вызывают его летальность. Максимальная же активизация пастерелл связана с их инкапсуляцией в условиях снижения температуры культивирования, что происходит с момента терминальных состояний и особенно после летальности организма. Очевидно, что при охлаждении капсульное вещество (токсин) становится вязким, в связи с чем остается на поверхности микробной клетки. Своевременное же выделение выраженно инкапсулированных пастерелл из трупов (через 3-4 посмертных часа) представляет возможность получать максимально активизированный высоковирулентный штамм бактерий. В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта по массе тела восприимчивого организма, по температурным параметрам и экспозиции.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

В исследованиях применяли типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida А:1 серовара, в частности коллекционированные в разное время и из разных регионов штаммы: Х-73 - эталонный из коллекции Хеддлестоуна, N 55, 115, 712, 915, 1931 - контрольно-производственные из коллекции ВГНКИ ветпрепаратов и пять вирулентных полевых. Этот микроорганизм наиболее распространен и повсеместно вызывает пастереллез птиц (по нашим данным в 89% случаев энзоотий). Его свойства изучали посредством световой микроскопии и биологической пробы. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.

Пример 1. Подбирали высоковосприимчивую к заражению пастереллами биомодель. Биопробу ставили на эмбрионах кур, голубях, белых мышах, кроликах, циплятах-бройлерах, курах, утках. Заражающий материал - клонированные 8-часовые бульонные культуры пастерелл в s-форме. Объемная доза заражающего материала при инфицировании организма - 0,1 мл. Эмбрионы кур заражали в хориоаллантоионую полость, все остальные организмы - внутримышечно. В итоге проведения биологических проб наиболее восприимчивыми к заражению пастереллами признаны голуби. С момента заражения они гибли через 10-12 часов, тогда как все остальные организмы - на протяжении 16-36 часов. Таким образом, голубь, как высоковосприимчивая к заражению пастереллами биомодель, отобран для постановки последующих экспериментов.

Пример 2. Отмечали капсулообразование у пастерелл в зависимости от пути заражения птиц (см. таблицу). Естественный путь заражения птиц - оральный (на слизистую оболочку небной щели). Искусственный способ заражения птиц, минуя "ворота" инфекции и защитные барьеры организма, - внутримышечный (в грудную мышцу). Заражающий материал - кровь из сердца трупа птицы, остывшего при 20^oC. Объемная доза заражающего материала при инфицировании организма птицы - 0,1 мл. При выраженной инкапсуляции и биполярности пастерелл в трупе птицы, павшей в результате естественного заражения, через 3 посмертных часа брали кровь из сердца и заражали орально и внутримышечно по 5 птиц. При развитии септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены пробы крови и готовили на предметных стеклах мазки. От павших же птиц брали кровь из сердца на протяжении 3 посмертных часов через каждые 15 минут, далее через каждый час до 10 посмертных часов и также готовили на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали, окрашивали по общепринятым методам и изучали путем световой микроскопии. Морфология пастерелл в препаратах, приготовленных из проб крови от перорально зараженных птиц, аналогична описанной в патенте РФ N 2051970, опублик. 01.96 г. При таком заражении птиц пастереллы на слизистой оболочке ротовой полости быстро утрачивали капсулу, инвазировали, размножались в крови в виде бескапсульных очень маленьких по величине коккоподобных бактерий (под микроскопом при слабом вращении микровинта). В период терминальных состояний организма или обычно с момента летальности его пастереллы начинали инкапсулировать. Капсула развивалась постепенно и равномерно и, как правило, была наиболее выражена у бактерий в трупах птиц по истечении 3 посмертных часов. Однако в трупах птиц после 4 посмертного часа это свойство у пастерелл уже ослабевало и в последующее время, например, по 10 посмертный час (срок наблюдения), было нестабильным. Динамика капсулообразования у пастерелл при внутримышечном заражении птиц наглядно отличалась от предыдущей. Так, при развитии септицемии у птиц пастереллы были в виде слабо инкапсулированных средних и больших по величине коккоподобных бактерий, в период же терминальных состояний организма и особенно в момент летальности его - в виде выраженно инкапсулированных, а уже в трупах по истечении первого посмертного часа это свойство их ослабевало и в последующее время наблюдения было нестабильным. Вышеизложенное свидетельствует, что динамика капсулообразования у пастерелл в организме и трупах птиц отличается в зависимости от пути заражения. Бактерии наиболее и равномернее инкапсулированы в трупах перорально зараженных птиц через 3 посмертных часа.

Пример 3. Устанавливали патогенность выращенных в организме пастерелл при разном сроке выделения их из трупа птицы. Так, из одного и того же трупа птицы, павшей в результате перорального заражения при 20^oC, брали пробы крови из сердца в момент летальности, а также через 3, 6 и 8 посмертных часов и в объемной дозе 0,1 мл соответственно заражали орально (на слизистую оболочку небной щели) по две интактных птицы. Поставлено пять аналогичных опытов. Птицы, инфицированные пробой крови, отобранной в момент летальности зараженного организма, были живы на протяжении трех суток (срок наблюдения). Другие же, инфицированные пробами крови, отобранными из трупов через 3, 6 и 8 посмертных часов, пали соответственно через 12-14, 16-20 и 24-36 часов. Вышеизложенное свидетельствует, что в трупе птицы, павшей в результате перорального заражения, в разное посмертное время пастереллы отличаются по степени патогенности. Микробы наиболее патогенны в трупах перорально зараженных птиц через 3 посмертных часа. Вероятно, что при пероральном заражении птиц пастереллы активно инвазируют в организм за счет выраженной капсулы, так как быстро утрачивают ее в месте аппликации.

Пример 4. Определяли вирулентность пастерелл при разном сроке выделения их из трупа птицы. В момент летальности перорально зараженной птицы, а затем через 3, 6 и 8 посмертных часов брали пробы крови из сердца и сразу соответственно высевали по 0,05 мл на бульон Хоттингера. При 37^oC получали опытные образцы 20-часовой бульонной культуры пастерелл и соответственно готовили на физрастворе в рабочем объеме 5,0 мл их разведения 10^-1 - 10^-10. Опытными образцами бульонной культуры в дозе 0,5 мл из разведений 10^-6 (1000 м. к. /0,5 мл), 10^-7 (100 м.к./0,5 мл), 10^-8 (10 м.к./0,5 мл) и 10^-9 (1 м.к. /0,5 мл) соответственно заражали внутримышечно по 3 птицы. Результаты биопробы учитывали 7 суток (срок наблюдения) и по каждому опытному образцу бульонной культуры пастерелл устанавливали минимальную смертельную дозу (ЛД₁₀₀). Так поставлено пять аналогичных опытов. В итоге ЛД₁₀₀ обычно соответствовала: по образцам при сроке выделения бактерий в момент летальности перорально зараженных птиц - 1000 м.к., по образцам при сроке выделения бактерий из трупа через 3, 6 и 8 посмертных часов - 1-10 м.к., 100-1000 м.к. и 1000 м.к. Таким образом, культуры, выделенные из трупа перорально зараженной птицы в разные посмертные часы отличаются по вирулентности при внутримышечном заражении птиц. Наиболее вирулентной является бульонная культура пастерелл, выделенная из трупа птицы через 3 посмертных часа (ЛД₁₀₀ равна 1-10 м.к.).

Пример 5. Определяли влияние температуры на капсулообразование и патогенность пастерелл, выращенных на питательной среде. В результате остывания 8-12-часовых свежевыделенных бульонных культур пастерелл в s-форме с 37^oC до уровня комнатной температуры (20-22^oC) через 2 часа после снятия их с культивирования отмечали при микроскопии парно расположенные выраженно инкапсулированные бактерии, а уже через 3 часа и в последующее время наблюдений (до 10 часов) этот морфологический признак был значительно утрачен и нестабилен. Напротив, в пробах аналогичных культур, соответственно охлажденных после культивирования с 37^oC до 4, 6, 8 и 10^oC, в те же сроки наблюдения пастереллы сохраняли первоначальную морфологию: слабоинкапсулированные кокко- и изредка - диплококкоподобные бактерии. В пробах же исходных культур при 37^oC (контроль) устанавливали только слабоинкапсулированные коккоподобные пастереллы. При внутримышечном заражении голубей патогенными были все культуры пастерелл независимо от влияния на них изучаемых температурных режимов. Однако при пероральном заражении птиц обычно были патогенными 8-10-часовые бульонные культуры пастерелл, применяемые сразу после снятия с культивирования (37^oC), и иногда пробы этих же культур, охлажденные после культивирования при 20^oC 2 часа. Результаты исследований свидетельствуют о влиянии температуры окружающей среды на инкапсуляцию и инвазивность пастерелл, выраженных на питательной среде.

Пример 6. Определяли влияние температуры на капсулообразование и патогенность пастерелл, выращенных в организме птиц. В момент летальности перорально зараженных птиц брали пробы крови из сердца и соответственно помещали при 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, а также при 15-37^oC (диапазон наблюдения). Из этих проб инфицированной крови на протяжении 5 часов с момента отбора (срок наблюдения) через каждый час соответственно готовили препараты для микроскопии. Одновременно же эти пробы материала проверяли на заражающую эффективность при внутримышечном и пероральном заражении интактных птиц в объемной дозе 0,1 мл. Пастереллы в пробах крови при 2-10^oC не инкапсулировали, при 12, 14 и при 30-37^oC инкапсулировали очень слабо, тогда как при 15-25^oC - выраженно. Причем наиболее выраженно бактерии инкапсулировали при 18-22^oC, оптимальным же стабильным параметром признан 20^oC. Пастереллы во всех пробах крови независимо от влияния на них изучаемых температурных режимов были патогенными при внутримышечном заражении птиц. Однако при пероральном заражении птиц обычно погибали те, которых инфицировали пастереллами из проб крови при 18-22^oC. При аналогичном же заражении, но пастереллами из проб крови при 30-37^oC, а также при 10^oC и ниже птицы, как правило, не погибали. Из вышеизложенного следует, что температура окружающей среды влияет на инкапсуляцию и патогенность (в частности - на инвазивность) пастерелл, выращенных в организме птиц. Оптимальным же стабильным параметром температуры для выраженной инкапсуляции пастерелл целесообразно считать 20^oC.

Пример 7. Определяли влияние низкой плюсовой температуры на патогенность, в частности - на инвазивность, выраженно инкапсулированных пастерелл при пероральном заражении птиц. С этой целью ставили биопробы при 0-10^oC (диапазон наблюдения). Контрольную биопробу ставили при 20^oC. В качестве заражающего материал с наличием выраженно инкапсулированных пастерелл применяли кровь из сердца трупа естественно зараженной птицы через 3 посмертных часа, остывшего при 20^oC. Объемная доза заражающего материала - 0,1 мл. В биопробах при 0-10^oC птицы погибали через 10-11, а при 20^oC - через 12-14 часов. При этом пастереллы через 10-15 минут с момента аппликации на слизистую оболочку ротовой полости птиц утрачивали капсулу, биполярность и оформлялись в коккоподобные бактерии. Замечено, что коккоподобные пастереллы на слизистой оболочке ротовой полости птиц в биопробах при 0-10^oC, причем особенно при 0-6^oC, были значительно меньше по величине, чем в контрольных биопробах при 20^oC. Вышеизложенное свидетельствует, что при пероральном заражении птиц низкая плюсовая температура (0-10^oC) не исключает, а даже усиливает патогенность, в частности - инвазивность, выраженно инкапсулированных при 20^oC пастерелл. В целях стандартизации условий постановки биопробы для точности воспроизведения результатов заражения птиц пастереллами необходимо соблюдать в работе параметр низкой плюсовой температуры, например, 4^oC.

Пример 8. Определяли влияние низкой плюсовой температуры (4^oC) на патогенность пастерелл в трупах перорально зараженных птиц через 3 посмертных часа. С этой целью ставили биопробы в двух вариантах: 1) птиц заражали при 4^oC, с момента их летальности трупы остывали в одном случае при 4^oC, в другом - при 20^oC; 2) птиц заражали при 20^oC, с момента их летальности трупы остывали в одном случае при 20^oC, в другом - при 4^oC. В качестве заражающего материала применяли кровь из сердца трупа естественно зараженной птицы через 3 посмертных часа, остывшего при 20^oC. Объемная доза заражающего материала - 0,1 мл. Как правило, зараженные птицы погибали быстрее в биопробах при 4^oC. Так, зараженные при 4^oC погибали через 10-11, а зараженные при 20^oC - через 12-14 часов. Трупы павших птиц вскрывали через 3 посмертных часа и брали пробы крови из сердца на предмет подтверждения патогенности пастерелл по каждому изучаемому варианту подготовки заражающего материала конкретно. Патогенность бактерий проверяли при внутримышечном и пероральном заражении интактных птиц в объемной дозе 0,1 мл заражающего материала. При отборе проб заражающего материала из трупов птиц, остывших при 20^oC, пастереллы были несколько больше инкапсулированы, чем из трупов птиц, остывших при 4^oC. Как правило, при внутримышечном заражении гибель птиц вызывала каждая изучаемая проба заражающего материала. С момента заражения птицы погибали через 10-11 часов. Вместе с тем при пероральном заражении гибель птиц вызывали только пробы заражающего материала из трупов, остывших при 20^oC, причем быстрее, если биопробы ставились при 4^oC. При этом птицы погибали в течение 10-12 часов. Пробы же заражающего материала из трупов, остывших при 4^oC, независимо от исходной температуры постановки биопроб не вызвали гибель птиц. Как правило, результаты биопроб были отрицательными не только при 20^oC, но и при 4 и даже -10^oC. Следовательно, низкая плюсовая температура усиливает патогенность, в частности - инвазивность, пастерелл при пероральном заражении птиц неохлажденным заражающим материалом (например, 20^oC), тогда как исключает это свойство у бактерий в результате охлаждения заражающего материала (например, при 4^oC).

Пример 9. При пероральном заражении птиц в биопробах при 10...-10^oC проверяли патогенность выраженно инкапсулированных вирулентных пастерелл в неохлажденном (20^oC) и в охлажденном (при +10...-10^oC) патологическом материале. Контрольные биопробы ставили при 20^oC. В качестве заражающего патологического материала применяли кровь из сердца трупов естественно зараженных птиц через 3 посмертных часа, при 20^oC. Экспозиция охлаждения проб заражающего материала при +10...-10^oC была 1 час. Объемная доза заражающего материала при инфицировании одной птицы - 0,1 мл. В результате заражения птиц пробами неохлажденного патологического материала биопробы были положительны. Птицы погибали в течение 10-14 часов. Напротив, все биопробы были отрицательны в результате заражения птиц пробами охлажденного патологического материала. Птицы были живы в течение 24 часов (срок наблюдения). При этом контрольные биопробы (при 20^oC) в первом случае были также положительны, а во втором - отрицательны.

Таким образом, вирулентные пастереллы при +10...-10^oC (диапазон наблюдения) охлаждения инфицированного материала утрачивают, тогда как при этих же параметрах температуры в результате перорального заражения птиц неохлажденным инфицированным материалом (20^oC) выраженно проявляют свойство инвазивности.

Пример 10. Наблюдали энзоотии пастереллеза птиц в весенний и осенне-зимний периоды года. На примере 8 неблагополучных хозяйств ежесуточно учитывали падеж птиц. При этом каждый раз регистрировали температуру воздуха в птичниках, а также снаружи, где расположены выгульные дворы для птиц. В результате проведенных наблюдений установлена прямая зависимость динамики падежа птиц от температуры окружающей среды. Так, падеж птиц за сутки обычно был наибольшим (150-300 голов из расчета на 10 тыс. птиц), если они находились в условиях при колебании температуры в пределах 5-20^oC (диапазон наблюдения). Если же температура окружающей среды для птиц сохранялась в течение суток не более 10^oC падеж птиц сокращался (10-50 голов из расчета на 10 тыс. птиц). В случаях сильного похолодания, когда температура воздуха как в помещениях, так и снаружи их (на территории выгульных дворов) снижалась до 0...-10^oC (диапазон наблюдения), падеж птиц прекращался. Если же температура воздуха в помещениях была выше 10^oC, а снаружи их - 0^oC и ниже инфекция не прекращалась и даже усиливалась. Изложенное свидетельствует о прямой зависимости проявления пастереллеза птиц от температуры окружающей среды.

Использование: биотехнология, микробиология, стандартизация контрольно-производственных штаммов пастерелл, диагностика пастереллеза птиц, вирулентность Pasteurella multocida. Сущность изобретения: заражение птицы производят пробой инфицированной крови, отобранной через 3-4 посмертных часа из сердца павшей в результате перорального заражения птицы, остывшей с момента летальности при 15-25^oC, после нанесения крови на слизистую оболочку небной щели птицу содержат при 0-10^oC и с момента агонии - при 15-25^oC. Выделение наиболее вирулентных инкапсулированных бактерий проводят из крови сердца трупа, отобранной через 3-4 посмертных часа. 1 табл.

Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida, включающий заражение птиц и выделение бактерий из трупов, отличающийся тем, что заражение осуществляют путем нанесения на слизистую оболочку небной щели пробы крови, отобранной через 3-4 посмертных часа из сердца птицы, павшей в результате перорального инфицирования возбудителем пастереллеза и остывшей с момента летательности при 15-25^oC, после заражения птицу содержат при 0-10^oC и с момента агонии - при 15-25^oC, а выделение наиболее вирулентных инкапсулированных бактерий проводят из крови сердца трупа, отобранной через 3-4 посмертных часа.