СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИЗОЛЯЦИИ ПАТОГЕННЫХ ПАСТЕРЕЛЛ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ К МОМЕНТУ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и предназначено для получения и сохранения патогенных штаммов пастерелл, а также в целях эпизоотологии и эпидемиологии пастереллезов и близких к ним заболеваний.

Пастереллы - аэробы или факультативные анаэробы, оптимально культивируются при температуре 37°С и рН 7,2-7,4 в виде коккобактерии, в неоптимальных условиях полиморфны, вариабельны, в естественных условиях спонтанно ослабляют и восстанавливают свою вирулентность, вызывают заболевание птиц и млекопитающих, включая человека (Н.М.Никифорова, 1962; И.В.Домарадский, 1971; В.Л.Семиотрочев и др., 1985). Микроб проявляет себя от крайне ослабленного при пастереллоносительстве до сильновирулентного возбудителя болезни в регионах с теплым и умеренным климатом, чаще в период дождей и резких колебаний температуры воздуха, и патогенетически особенно опасен для птиц, так как обычно вызывает опустошительные эпизоотии, нанося чрезвычайный ущерб (Г.Л.Пустовит, 1965; Е.И.Буткин, 1972). От безысходности в такой ситуации большинство исследователей склонны утверждать причиной в основе развития пастереллеза различные предрасполагающие факторы, особенно метеофакторы, прежде всего температуру и влажность окружающей среды, снижающие естественную резистентность макроорганизма. Однако в связи с естественной резистентностью птиц реальная ситуация в развитии пастереллеза совершенно противоположная. Как ни странно, с внезапным появлением и очень быстрым ("молниеносным") развитием заболевания обычно первыми гибнут самые активные, упитанные и сильные птицы. Издавна так называемый "парадокс вирулентности" возбудителя пастереллеза, когда в природе восприимчивые организмы заражаются легко и быстро, а в экспериментах при естественных путях инфицирования далеко не всегда возможно вызвать заболевание (П.В.Сизов, 1931; Е.И.Буткин, 1972), не находит точного объяснения. При этом известно, что утрата ила же восстановление вирулентности и, как правило, капсулы, капсульного антигена (К-антигена), а также иммуногенности пастерелл сопровождается диссоциацией их микробной клетки, выявляемой по изменению колоний (S-, М-, R- формы и S^R- или R^S- переходные формы) (G.R.Carter, Е.Annau, 1953; G.R.Carter, C.H.Rigland, 1953; G.R.Carter, 1957; A.H.Борисенкова, 1979). Условия этого процесса, особенно по части восстановления биологических свойств пастерелл, почти не изучены. Однако в целях изготовления качественных биопрепаратов получение и сохранение контрольно-производственных штаммов пастерелл по морфологии и вирулентности является задачей первостепенной важности. Поэтому микроорганизмы пассируют через восприимчивый организм (обычно по источнику происхождения бактерий) путем инъекции и сохраняют лиофилизированными ("Вет. препараты", М., 1981. С.238). Но и при этом штаммы бактерий значительно не соответствуют своему стандарту биологических свойств по паспорту. Из-за сложности и слабой изученности свойств возбудителя пастереллеза эта задача по-прежнему решается эмпирически, в связи с чем и безуспешно.

В предыдущей работе, заключающейся в повышении точности условий выявления и выделения пастерелл (Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г., Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г.), в объяснении феномена биполярности пастерелл (Ж. "Доклады Россельхозакадемии", 1996. №5. С.32-35), в установлении условий повышения (восстановления) вирулентности пастерелл (Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г.), а также в разработке вакцины для профилактики пастереллёза птиц и способа ее получения (Патент РФ №2199341 от 27.02.2003 г.), показана взаимосвязанная инфекционная природа пастерелл в капсульном и бескапсульном вариантах микробной клетки в зависимости от температуры окружающей среды. Морфо- и термолабильность пастерелл, путь заражения восприимчивого организма и температура окружающей среды играют главную роль в проявлении патогенных свойств микроба и в развитии заболевания. В этом и заключается принцип восстановления биологических свойств у пастерелл. Поскольку микроб в биологическом цикле своего развития адаптируется от ярко выраженного аэроба без капсулы в организме при септицемии до факультативного анаэроба в выраженной капсуле в трупе птицы, обособление сильновирулентных с выраженной инвазивностью пастерелл попарно ("биполярно") в выраженную капсулу является показателем стандартизации любого патогенного штамма пастерелл. Достоверность воспроизведения этого показателя достигается в результате выполнения стандарта условий биопробы в зависимости от пути и способа заражения, температуры окружающей среды, массы тела павшего, время вскрытия трупа после смерти, а также от органа или же, точнее, от глубины точки изоляции микроба из остывающего тела трупа. При этом изоляция биологически полноценной (стандартизированной) микробной клетки пастерелл из трупа должна быть выполнена своевременно. Поскольку для лабораторной практики вышеизложенное является неизвестным, важные проблемные вопросы пока еще решаются необъективно.

Существующий норматив условий пассажа штаммов пастерелл через восприимчивый организм для последующей лиофилизации бактерий не представляет возможность получения и сохранения патогенных микроорганизмов идентичными исходным по морфологии и вирулентности (инвазивности). Известные способы хранения патогенных пастерелл также недостаточно результативны.

Лиофилизация - известный, общепризнанный, безусловно надежный и эффективный способ хранения микроорганизмов. Однако, что же касается пастерелл со свойственной им термолабильностью, то действие низкой температуры, как одно из условий этого способа, блокирует их инвазивность. И, поэтому, такой микробной клеткой пастерелл вызвать заражение восприимчивого организма при инфицировании на слизистую верхних дыхательных путей ("ворота инфекции") не всегда представляется возможным, а если часть зараженных и гибнет, то значительно в поздние сроки биопробы. Регидратированные из лиофилизированного состояния пастереллы не способны внедряться через первичные естественные барьеры восприимчивого организма и только при инъекции, минуя существенную часть защитных сил, проявляют патогенность. Следовательно, существенным недостатком лиофилизации пастерелл для хранения и, затем, применения бактерий является блокирование их термолабильной микробной клетки по свойству инвазивности действием низкой температуры как неотъемлемой составляющей этого способа. Лиофилизация, как способ хранения микроорганизмов, не всегда и не везде является доступной, так как для ее осуществления необходимо специальное оборудование и, соответственно, его квалифицированное обслуживание.

Сохранение пастерелл по морфологии и вирулентности (инвазивности) является проблемным вопросом и зависит от условий биологической изоляции их микробной клетки. Первые попытки сохранить микроб "холеры кур" (возбудителя пастереллёза) идентичным исходному предприняты Луи Пастером (1860). Ученый изолировал возбудитель болезни от кислорода атмосферного воздуха, запаивая пробирку с культурой бактерий на курином бульоне, и отмечал о сохранении его вирулентным. В связи с этой работой Ф.Р.Писковой и З.Н.Кравченко (1965) сообщили, что культуры пастерелл, выращенные на 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом, продолжительно жизнеспособны и иммуногенны и, причем, в сохранении этих свойств меньшее значение представляют содержание в питательной среде сывороток крови, их концентрация и принадлежность крови тому или иному виду животных. Обе работы по целесообразности сохранения пастерелл путем изоляции от атмосферного воздуха в условиях анаэробиоза существенно не отличаются и в качестве принципиально близких взяты за прототип. Существенным недостатком этих способов является неполная изоляция пастерелл от окружающей среды в условиях анабиоза. Бактерии, являясь нестрогими аэробами, продолжая культивироваться в качестве факультативного анаэроба, постепенно размножаются и диссоциируют, соответственно утрачивая свои биологические свойства. Согласно учению Луи Пастера о направленной изменчивости патогенных микроорганизмов задача по ослаблению биологических свойств пастерелл давно решена, тогда как противоположная задача - по восстановлению и сохранению их идентичными исходным в условиях, близких к природным, - оказывается весьма сложной и пока еще не решена. Поэтому патогенные штаммы пастерелл получают и поддерживают (сохраняют) в лабораторных условиях недостаточно качественными по состоянию выраженности биологических свойств.

Задачей изобретения является получение и сохранение патогенных штаммов пастерелл идентичными исходным по морфологии и вирулентности (инвазивности) путем повышения точности условий выполнения пассажа бактерий через восприимчивый организм и биологической изоляции их от окружающей среды в условия анабиоза.

Поставленная задача достигается тем, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают на слизистую верхних дыхательных путей и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца. В крови выявляют изолировавшиеся попарно ("биполярно") в выраженную капсулу пастереллы. Одновременно пастереллы изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба и способные при культивировании давать рост колоний только S-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования.

Существенным отличием является то, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают на слизистую верхних дыхательных путей и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца. В крови выявляют изолировавшиеся попарно ("биполярно") в выраженную капсулу пастереллы. Одновременно пастереллы изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба и способные при культивировании давать рост колоний только S-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования.

В работе целесообразно придерживаться определенного стандарта по массе тела восприимчивого организма, по способу заражения его на слизистую верхних дыхательных путей и заражающему материалу, по температурным параметрам и экспозиции.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В исследованиях применяли типичный возбудитель пастереллёза птиц Pasteurella multocida A:I серовара как наиболее распространенный и повсеместно вызывающий заболевание (по нашим данным в 89% случаев эпизоотии). В частности, использовали коллекционированные в разное время и из разных регионов штаммы: Х-73 - эталонный из коллекции Хеддлестоуна, №55, №115, №712, №915, №1931 - контрольно-производственные из коллекции ВГНКИ ветпрепаратов и пять вирулентных полевых. Свойства этих микроорганизмов изучали посредством световой микроскопии, биологической пробы, культивирования на плотной и в жидкой питательных средах, изоляции в физиологическом растворе и в жидкой питательной среде. В качестве наиболее восприимчивой к заражению пастереллами лабораторной биомодели использовали организм голубя массой тела 300-350 г. Препараты для микроскопии окрашивали по Гинсу, Романовскому-Гимза, Граму.

Пример 1

Готовили биологически полноценную микробную клетку пастерелл для изоляции от окружающей среды. С этой целью изучаемые микроорганизмы соответственно стандартизировали путем пассажа через восприимчивый организм при определенных условиях. В качестве восприимчивого организма использовали голубя массой тела 300-350 г. Организм установленной массы тела заражали остывшей бульонной культурой капсулированных пастерелл первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С, объем 5 мл) в дозе 0,3 мл интраназально - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Каждого зараженного содержали и с момента гибели его труп остывал при 15...25 (оптимум 20±1)°С окружающей среды. С 3 по 4 ч после смерти труп вскрывали, сразу же брали кровь из сердца и в крови выявляли выражено капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы. Эти результаты аналогичны описанным в предыдущих работах: Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. и Патент РФ №2123531 от 20.12.1998 г. Микроорганизмы в таком качестве морфологических и вирулентных свойств в крови из сердца павшего считали стандартизированными и биологически полноценными для изоляции от окружающей среды. Полную капсуляцию пастерелл решено использовать как биологический результат их собственной изоляции, сохраняющий свойства микробной клетки в качестве факультативного анаэроба в условиях анабиоза.

Пример 2

Биологически полноценную по морфологии и вирулентности микробную клетку пастерелл, подготовленную согласно примеру 1, изолировали от окружающего питательного субстрата и атмосферного воздуха. Для этого трупы зараженных голубей, остывшие при 20±1°С окружающей среды, вскрывали через 3 ч после смерти и из крови сердца изолировали от питательного субстрата выражено капсулированные, биполярные, сильновирулентные (с выраженной инвазивностью) пастереллы на равный по температуре физиологический раствор (20±1°C; рН 7,0). Брали 0,2 мл (4 капли) инфицированной крови и вносили в 1,8 мл физраствора, содержимое встряхивали в течение 1 мин и центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. Надосадочную жидкость считали изолятом биологически полноценных пастерелл из крови в разведении 10 и использовали для приготовления последующих 10-кратных разведений его на физрастворе в рабочем объеме 5 мл, соответственно высевая по 0,5 мл и в жидкую питательную среду объемом по 4,5 мл. Пастереллы в разведениях 10^-2, 10^-3 и 10^-4 на физрастворе и в жидкой питательной среде соответственно изолировали по 0,5-1,0 мл в пастеровские пипетки (предварительно оплавленные по форме ампул с истонченными промежутками или концами в виде капилляров), заполняя по объему, насасывая резиновой грушей, герметично запаивая концы над пламенем огня, дополнительно парафинируя конец последней пайки и горизонтально располагая для изучения на сохранность биологических свойств микробной клетки. Морфологически это были грамотрицательные, капсулированные, одинаковые коккобактерии, обособленные поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе, как и описано в предыдущих работах: Патент РФ №2005790 от 15.01.1994 г. и Патент РФ №2051970 от 10.01.1996 г. Все изолированные микроорганизмы давали при культивировании на плотной питательной среде рост колоний только S-формы. Результаты культивирования 10-кратных разведений изолятов пастерелл в жидкой питательной среде при 37±1°С через 15-24 ч свидетельствовали о характерном росте культуры бактерий первой генерации (нежное равномерное помутнение, чуть с голубовато-бирюзовый оттенком на естественном свету, при встряхивании в виде так называемых "муаровых волн", со специфическим запахом) по разведение 10^-7, изредка - по разведение 10^-6 или 10^-8. В пересчете на исходную концентрацию микроба в крови на момент его изоляции, исходя из роста культуры пастерелл по предельному разведению 10^-7, определено около 20 млн м.к./мл, а его изолятов в разведениях 10^-2, 10^-3 и 10^-4 - 200, 20 и 2 тыс. м.к./мл соответственно. При этом микроорганизмы в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С), приготовленной путем посева 0,5 мл изолята пастерелл из разведения 10^-3 (10 тыс. м.к.) в жидкую питательную среду объемом 4,5 мл, в дозе 0,3 мл (около 300 млн. м.к.) соответственно при введении внутримышечно и интраназально вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч. Вышеизложенные результаты культурально-морфологических и биологических исследований микроорганизмов, установленные на дату изоляции их микробной клетки, обозначили исходными (контрольными) по отношению к определяемым при последующем изучении изолятов бактерий в зависимости от условий хранения.

Пример 3

Микробную клетку пастерелл, биологически подготовленную и изолированную согласно примерам 1 и 2, изучали на жизнеспособность в зависимости от условий хранения: 1) при анаэробиозе в физиологическом растворе соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды; 2) при анаэробиозе в жидкой питательной среде соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды. В каждом конкретном случае контрольного анализа микробную клетку изолята пастерелл, осевшую по внутренней поверхности запаянной пастеровской пипетки (ампулы), переводили во взвесь путем вращения ампулы между ладонями рук. Затем удостоверялись в герметичности укупорки ампулы, обломив ее конец первой пайки, опустив, при этом, другой (парафинированный) в стерильную пробирку Флоринского. Если содержимое ампулы не истекало, то изолят пастерелл считали хранившимся без доступа атмосферного воздуха (в условиях анаэробиоза). Перевернув ампулу, направив ее вскрытый конец в эту же пробирку, содержимое извлекали, оно истекало, если нарушали целостность запаянного противоположного (парафинированного), обламывая его. Жизнеспособность изолятов пастерелл идентифицировали культурально-морфологически. Содержимое из ампул высевали по 0,5 мл на плотную питательную среду в чашки Петри и в 4,5 мл жидкой питательной среды, культивировали при 37±1°С 15-24 ч. Отличие культурально-морфологических свойств микроба от его исходных (контрольных), описанных в примере 2, или же отсутствие роста культуры бактерий свидетельствовало о влиянии условий хранения на жизнеспособность микробной клетки изолятов пастерелл. Напротив, микробную клетку изолятов пастерелл, дающую при культивировании на плотной питательной среде рост колоний S-формы, отождествляли, по жизнеспособности идентичной исходной. Герметично укупоренные изоляты пастерелл выражено сохранялись жизнеспособными, тогда как в случае доступа атмосферного воздуха они диссоциировали и сравнительно быстрее отмирали. Характерно, что в верхнем уровне жидкой питательной среды уже в 3-4 ч культивирования при 37±1°C было заметно размножение пастерелл в виде слабого помутнения, которое постепенно, равномерно распространялось вниз на весь ее объем к 7-8 ч роста культуры бактерий. Изоляты пастерелл в физрастворе без доступа атмосферного воздуха при 20 и 5±1°С окружающей среды были жизнеспособны 10-15 и 3-5 суток соответственно. Так, хранящиеся при 20±1°С давали при культивировании на плотной питательной среде рост колоний S-формы идентично исходным (контрольным). В то же время хранящиеся при 5±1°C окружающей среды частично диссоциировали и в тех же условиях культивирования давали рост колоний S-, М- и R- формы. При культивировании таких изолятов пастерелл в жидкой питательной среде происходило помутнение ее наглядно больше, чем было исходное (контрольное). При этом на естественном свету цвет культуры диссоциированных пастерелл был с голубовато-желтоватым оттенком, тогда как при оценке исходной (контрольной) культуры пастерелл - с голубовато-бирюзовым оттенком. При каждом хранении изолятов пастерелл окончание периода их жизнеспособности проявлялось крайне ослабленным свойством культивироваться и последующим полным отмиранием микробной клетки в течение 24 ч, в связи с чем бактериологические посевы на плотную и в жидкую питательные среды оставались стерильными. В итоге было очевидным, что жизнеспособность биологически полноценной микробной клетки пастерелл в условиях изоляции от атмосферного воздуха и питательного субстрата зависит и от температуры окружающей жидкой среды.

Таким образом, биологически полноценная микробная клетка пастерелл, обособленная в капсуле, сохраняет культурально-морфологические свойства идентичными исходным в условиях без атмосферного воздуха, питательного субстрата и при 20±1°С (оптимум) окружающей жидкой среды (например, в физиологическом растворе не изменяется к моменту использования в течение 10 суток).

Изоляты пастерелл в жидкой питательной среде без культивирования и без доступа атмосферного воздуха соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды еще более существенно отличались жизнеспособностью и, причем, прямо противоположно хранящимся в физрастворе. Так, у хранившихся при 20±1°C в связи с размножением их микробной клетки в течение 2-3 суток происходило легкое помутнение среды и в ампулах через 5-7 суток формировался слизистый осадок из диссоциированных микробных клеток, которые при контрольном анализе культивирования обычно давали рост колоний М- и R- форм, а на 10-15 сутки хранения - рост колоний R-формы и, затем, полностью отмирали. Напротив, хранившиеся в состоянии анабиоза при 5±1°С в жидкой питательной среде, при полной прозрачности ее в ампулах, в случае культивирования давали идентично исходным (контрольным) рост колоний S-формы и сохранялись жизнеспособными в течение 3 месяцев (срок наблюдений). Если температурный режим хранения изолятов пастерелл изменялся или же колебался на 5°С и более, то эти бактерии диссоциировали и при контрольном анализе культивирования давали рост колоний М- и R-форм, отмирая по мере доминирования последней. В итоге было очевидным, что биологически полноценная микробная клетка пастерелл, обособленная в капсуле, длительно сохраняется в жидкой питательной среде в состоянии анабиоза без доступа атмосферного воздуха и при стабильной температуре, например 5±1°С, окружающей среды.

Таким образом, биологически полноценная микробная клетка пастерелл в капсуле, изолированная из крови сердца в жидкую питательную среду и некультивированной введенная без доступа атмосферного воздуха и при 5±1°С окружающей среды в состояние анабиоза, длительно сохраняет культурально-морфологические свойства идентичными исходным (культивируется в S-форме колонии; срок наблюдений 3 месяца).

Пример 4

Микробную клетку пастерелл, биологически подготовленную и изолированную согласно примерам 1 и 2, изучали на вирулентность в зависимости от условий хранения: 1) при анаэробиозе в физиологическом растворе соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды; 2) при анаэробиозе в жидкой питательной среде соответственно при 20 и 5±1°С окружающей среды. С этой целью удостоверялись в герметичности укупорки ампул и извлекали их содержимое, как описано в примере 3. Микроорганизмы непосредственно из ампул в дозе около 10000 м.к./0,5 мл предварительно за сутки выверенных жизнеспособными из конкретного разведения (например, из разведения 10^-3), и в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий первой генерации 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С), приготовленной как и в примере 2, в дозе около 300 млн. м.к./0,3 мл изучали на вирулентность соответственно при введении внутримышечно и интраназально. Внутримышечно вводили всю дозу в одну точку грудной мышцы, а интраназально - по полдозы в обе ноздри на слизистую носовой и ротоглоточной полостей. Микробную клетку изолятов пастерелл идентифицировали вирулентной по гибели зараженных в течение 48 ч (срок наблюдений). В каждом конкретном случае контрольного анализа все жизнеспособные изоляты пастерелл, дающие при культивировании рост колоний S- и М-форм, при введении внутримышечно вызывали гибель голубей в течение 10-30 ч, а в R-форме по росту колоний были авирулентны. Изоляты пастерелл в физрастворе при 5±1°С и в жидкой питательной среде при 20±1°C в течение 2-5 суток диссоциировали и, как утратившие исходные биологические свойства, в последующем не изучались. Характерно, что исходную S-форму колоний при культивировании и вирулентность не изменяли только изоляты пастерелл, изначально сохраняющиеся без доступа атмосферного воздуха в физрастворе при 20±1°С в течение 10 суток и в жидкой питательной среде при 5±1°С в течение 3 месяцев (срок наблюдений). Эти микроорганизмы непосредственно из ампул и в качестве бульонной культуры капсулированных бактерий при внутримышечном введении вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч. В итоге было очевидным, что микробная клетка изолятов пастерелл идентична исходной по вирулентности и, по-прежнему, дает при культивировании рост колоний S-формы, если сохраняется в состоянии анабиоза. Однако при внутримышечном заражении восприимчивого организма точно установить и объяснить зависимость вирулентности изолятов пастерелл от условий их подготовки и хранения, даже при явной диссоциации микробной клетки, не представлялось возможным. Напротив, при заражении голубей на слизистую верхних дыхательных путей наблюдали выраженную зависимость вирулентности микроорганизмов от температуры окружающей среды. Так, микробная клетка изолятов пастерелл в состоянии анабиоза, хранящаяся без доступа атмосферного воздуха в физрастворе при 20±1°С в течение 10 суток, непосредственно из ампул введенная интраназально, вызывала гибель голубей в течение 18-24 ч. Эти же микроорганизмы в качестве приготовленной бульонной культуры капсулированных бактерий, дающих рост колоний S-формы, при введении интраназально были также вирулентными - вызывали гибель голубей в течение 10-14 ч идентично исходным (контрольным). В то же время микробная клетка изолятов пастерелл в состоянии анабиоза, хранящаяся также без доступа атмосферного воздуха, но в жидкой питательной среде при 5±1°С в течение 3 месяцев (срок наблюдений), являясь выражено патогенной при внутримышечном введении непосредственно из ампул, не вызывала гибель птиц при инфицировании интраназально. Однако эти же микроорганизмы в качестве молодой бульонной культуры бактерий, капсулированных при 20±1°C в течение 1 ч (оптимум), при введении интраназально уже проявляли вирулентность, но менее выражено - вызывали гибель голубей в течение 24-48 ч. В итоге было очевидным, что неоптимальная температура окружающей среды значительно влияет на инвазивностъ пастерелл, лишая их возможности реализовать свою патогенностъ при естественном пути заражения восприимчивого организма - на слизистую верхних дыхательных путей. Это объясняется тем, что вирулентная микробная клетка пастерелл вместе со своим ферментом инвазивности гиалуронидазой в капсуле блокируются собственной же капсулой из-за ее уплотнения по консистенции под действием температуры окружающей среды ниже от оптимальной. Кроме того, в зависимости от температуры окружающей среды не менее существенное значение для хранения микробной клетки пастерелл представляет и сам питательный субстрат. Если бактерии хранить в состоянии анабиоза, например при 5±1°С окружающей среды, то капсула и питательный субстрат играют консервирующую и защитную роль. Однако при благоприятной температуре, например, при 20±1°С окружающей среды, причем, даже в условиях анаэробиоза, результат прямо противоположный. Микроб, являясь факультативным анаэробом, но не введенный в состояние анабиоза, усваивает через активную по инвазивности капсулу питательный субстрат и постепенно диссоциирует, соответственно утрачивая и капсулу с ферментом патогенности гиалуронидазой, и другие свои биологически ценные исходные свойства. Если же биологически полноценную капсулированную микробную клетку пастерелл, подготовленную согласно примеру 1, изолировать от питательного субстрата в условия анаэробиоза на физраствор при 20±1°С (оптимум) окружающей среды, то в создавшихся стабильных условиях анабиоза бактерии сохраняются уже идентичными исходным и, причем, с выраженным свойством инвазивности при заражении птиц на слизистую верхних дыхательных путей. Поэтому в целях получения биологически полноценной микробной клетки пастерелл следует воспроизводить и изолировать ее согласно примерам 1 и 2. Такую микробную клетку можно сохранять идентичной исходной к моменту использования без доступа атмосферного воздуха на физиологическом растворе при 20±1°С окружающей среды не более 10 суток (оптимум). Этого срока обычно достаточно, чтобы согласно цели и задач выполнить полезную работу с биологически полноценной, стандартизированной микробной штамма пастерелл (например, размножить и лиофилизировать правильно изолированный микроорганизм, или же вывести его из лиофилизированного состояния в полную биологическую активность, приготовить антиген или вакцину, поставить биопробу или же провести ряд научных исследований). Вместе с тем биологически полноценную микробную клетку пастерелл, обособленную в капсуле, введенную в состояние анабиоза без доступа атмосферного воздуха при 5±1°С в жидкой питательной среде, можно сохранять заблокированной по инвазивности для птиц при заражении на слизистую верхних дыхательных путей, но длительно продолжающей быть патогенной при инъекции (3 месяца, срок наблюдений).

Пример 5

Изучали микробную клетку эталонного штамма пастерелл Х-73 на культурально-морфологические свойства и заражающую эффективность в зависимости от способа хранения: 1) в состоянии анаэробиоза - на курином бульоне без доступа атмосферного воздуха по способу Л.Пастера (1880); 2) в состоянии анаэробиоза - на 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом по способу Ф.Р.Пискового и З.Н.Кравченко (1965); 3) в состоянии анабиоза - сухая (лиофилизированная) под вакуумом по общепринятому способу; 4) в состоянии анабиоза - биологически изолированная в собственной капсуле, при 20±1°С в физрастворе без доступа атмосферного воздуха по заявляемому способу; 5) в состоянии анабиоза - биологически изолированная в собственной капсуле, при 5±1°С в жидкой питательной среде без доступа атмосферного воздуха по заявляемому способу. Микробную клетку пастерелл, в каждом конкретном случае контрольного анализа, изучали в 10-суточном сроке хранения. Бактерии из условий хранения в пробирке или ампуле высевали в жидкую и на плотную питательные среды, культивировали при 37±1°С в течение 24 ч и сравнивали по культурально-морфологическим свойствам. Микробные образцы, соответственно способу хранения исходной микробной клетки, в качестве остывшей бульонной культуры капсулированных бактерий 10-часового возраста (9 ч при 37 и 1 ч при 20±1°С) проверяли на вирулентность в зависимости от способа заражения голубей - внутримышечно или интраназально. Технически заражение выполняли, как и в примере 4. Бактерии идентифицировали вирулентными по гибели зараженных птиц в течение 48 ч (срок наблюдений). Вместе с тем, исходные свойства микробной клетки пастерелл (рост колоний только S-формы на плотной и нежный голубовато-бирюзовый рост в жидкой питательных средах при культивировании и вирулентность с оценкой по инвазивности и скорости гибели зараженных через 10-14 ч), приведенные в примере 2, служили контрольными.

Пастереллы, являясь факультативными анаэробами, культивировались без доступа атмосферного воздуха, причем даже при температуре окружающей среды значительно ниже от оптимальной. Так, микробная клетка пастерелл в состоянии анаэробиоза по 1- и 2-му способам хранения медленно культивировалась в контрольных посевах без доступа атмосферного воздуха, в темноте, при 15-23°С окружающей среды. Бактерии, слабо усваивая питательный субстрат, постепенно в течение 3-4 суток размножались, затем частично изменялись (диссоциировали) и уже на 10-е сутки хранения давали при культивировании в контрольном посеве колонии М-формы, тогда как изначально исходной (контрольной) была только S-форма колоний. Аналогично и культура пастерелл, значительно быстрее выращенная в аэробных условиях при оптимальной температуре окружающей среды (37±1°С), после чего хранящаяся по 1- и 2-му способам без доступа атмосферного воздуха, на 10-е сутки уже тоже содержала диссоциированные микробные клетки, дающие при культивировании в контрольном посеве колонии только М-формы. При этом, как правило, микробные образцы в качестве бульонной культуры пастерелл вызывали гибель голубей при инъекции (например, внутримышечно). Зараженные гибли через 13-16 ч. В то же время эти бактерии при введении интраназально вызывали гибель голубей крайне изредка и не ранее чем через 30 ч.

Микробная клетка пастерелл по 3- и 5-му способам хранения, в отличие от хранящейся по другим изучаемым способам, сохранялась в состоянии анабиоза, вызванного под влиянием низкой температуры окружающей среды при стабильном режиме. Бактерии на 10-е сутки хранения были близки к исходным (контрольным). Однако эти бактерии при культивировании на плотной питательной среде давали рост колоний, близких к колониям S-формы исходного (контрольного) роста, и при этом по цвету уже с оттенком несколько подобным, как и у колонии М-формы. Также и при культивировании в жидкой питательной среде рост этих бактерий несколько отличался от исходного. Бульонная культура этих бактерий уже была менее прозрачная и несколько с голубовато-желтоватым оттенком в отличие от исходной (контрольной), которая нежнее, прозрачнее и с голубовато-бирюзовым оттенком на естественном свету. При этом изучаемые микробные образцы в качестве бульонной культуры пастерелл при введении внутримышечно вызывали гибель голубей через 10-12, а при введении интраназально - через 24-48 ч. Однако были случаи, когда при введении культуры пастерелл интраназально голуби не гибли в течение 48 и, даже, 72 ч (срок наблюдений).

Микробная клетка пастерелл по 4-му способу хранения, в отличие от хранящейся по всем другим изучаемым способам, сохранилась в состоянии анабиоза без влияния низкой температуры окружающей среды, являясь биологически изолированной от питательного субстрата и атмосферного воздуха в собственной капсуле на физиологическом растворе при 20±1°С (оптимум) окружающей среды. Бактерии на 10-е сутки хранения давали при культивировании в контрольном посеве рост колоний только S-формы идентично исходным (контрольным). Рост этих бактерий в жидкой питательной среде был тоже идентичен исходному (контрольному). При этом микробный образец в качестве бульонной культуры пастерелл с весьма выраженной заражающей эффективностью как при внутримышечном, так и при интраназальном введении вызывал гибель голубей через 9-13 ч с разницей в 1-2 ч. При многократном проведении культурально-морфологических и биологических исследований результаты были аналогичными.

Таким образом, хранение пастерелл в состоянии анабиоза является эффективным лабораторным опытом сохранения их биологических свойств. Биологически полноценная микробная клетка пастерелл, полученная в виде обособленной в выраженной капсуле коккобактерии и в качестве факультативного анаэроба, сохраняется в условиях анабиоза идентичной исходной в зависимости от температуры окружающей среды. Патогенные штаммы пастерелл характеризуются идентичными исходным по росту колоний S-формы на плотной питательной среде и по вирулентности (инвазивности) при заражении восприимчивого организма на слизистую верхних дыхательных путей.

Вышеизложенные результаты исследований в пяти приведенных примерах, подтверждающих возможность осуществления изобретения, многократно воспроизведены и использованы в целях разработки и применения метода биологического контроля иммуногенности вакцин против пастереллёза птиц, отличающегося большей объективностью постановки биопробы по заражению птиц, близко к природному. Исходя из установленного, предлагаемый способ содержит существенные отличия научно-практического значения и может быть использован в микробиологии, биотехнологии, эпизоотологии, эпидемиологии, а также в условиях современной биологической промышленности.

Способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ заключается в том, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают на слизистую верхних дыхательных путей, и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды. С 3 по 4 час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца. В крови выявляют изолировавшиеся попарно («биполярно») в выраженную капсулу пастереллы. Одновременно пастереллы изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых, капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе. Коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба и способные при культивировании давать рост колоний только s-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования. Способ позволяет получить патогенные штаммы пастерелл и сохранить их идентичными исходными по морфологии и вирулентности.

Способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования, включающий заражение восприимчивого организма возбудителем пастереллеза на слизистую верхних дыхательных путей, вскрытие павшего и изоляцию из крови биологически полноценной микробной клетки бактерий при определенных условиях, отличающийся тем, что восприимчивый организм установленной массы тела заражают и с момента гибели его труп остывает при 15...25 (оптимум 20)°С окружающей среды, с 3-го по 4-й час после смерти труп вскрывают и сразу же берут кровь из сердца, в крови выявляют изолировавшиеся попарно («биполярно») в выраженную капсулу пастереллы и одновременно их изолируют от питательного субстрата путем центрифугирования и разведений в физиологическом растворе (рН 7,0) в виде морфологически одинаковых капсулированных коккобактерий, обособленных поодиночке вследствие распада биполярной структуры микроба в жидкой фазе, после чего коккобактерии в собственной капсуле, полученные в качестве факультативного анаэроба, способные при культивировании давать рост колоний только s-формы, сохраняют в состоянии анабиоза в физиологическом растворе при температуре 20°С в течение 10 суток (оптимум) идентичными исходным по инвазивности или же в жидкой питательной среде при температуре 5°С (оптимум) длительно заблокированными по инвазивности без доступа атмосферного воздуха в наполненных, запаянных и горизонтально расположенных пастеровских пипетках к моменту использования.