ПСИХОТРОПНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области экспериментальной и клинической медицины, а именно к средствам, обладающим психотропным действием.

В экспериментальной медицине известно использование психотропных средств для создания экспериментальных моделей психомоторного возбуждения организма с целью исследования влияния последнего на выживаемость организма в стрессовой ситуации.

Известен, например, аминазин - нейролептик, обладающий сильным седативным эффектом, снижающий спонтанную двигательную активность, снижающий двигательно-оборонительные рефлексы.

Кофеин усиливает положительные условные рефлексы, повышает двигательную активность, повышает умственную и физическую работоспособность. Время действия на организм 4-6 ч.

Недостатком известного препарата является кратковременность действия (4-6 ч), а следовательно, необходимость частых инъекций для поддержания психостимулирующего эффекта. Кофеин, как и многие другие психотропные средства, является экзогенным препаратом, а значит - недостаточно физиологичен. Кроме того, при многократном воздействии кофеин оказывает влияние в основном на двигательную активность и лишь незначительно влияет на безусловные рефлексы (ориентировочно-познавательные) - т. е. не проявляет сочетанной психо-моторной активности.

Целью изобретения является расширение арсенала средств для пролонгированной регуляции психомоторной активности организма.

Поставленная цель достигается применением среднемолекулярных веществ, выделяемых нейрофилами человека, впервые в качестве психотропного средства.

Среднемолекулярные вещества нейтрофилов человека (СМВН) представляют собой продукты секреции этих клеток, получаемые после их инкубации в питательной среде с активатором и без него. Известны иммуностимулирующие свойства нейтрофилокинов (среднемолекулярных веществ, выделяемых нейтрофилами человека).

Авторами впервые установлено психотропное действие среднемолекулярных веществ, выделяемых нейтрофилами человека, а именно пептидсодержащей фракции активированных нейтрофилов человека с мол. м. от 500 до 10000 дальтон.

Среднемолекулярные вещества нейтрофилов получают следующим образом:
- венозную кровь в объеме 20 мл забирают в силиконизированную пробирку, содержащую гепарин (фирма Гедеон-Рихтер) в концентрации 25 ЕД/мл, перемешивают с 1,5 мл декстрана Т-500 и отстаивают при 37^оС в течение 30 мин для получения плазмы;
- плазму осторожно отсасывают и наслаивают на двойной градиент плотности фиколл-верографина (плотность верхнего градиента - 1,077, нижнего - 1,093) в силиконизированных центрифужных пробирках;
- после центрифугирования в течение 40 мин при 4^оС и 1500 об/мин (в рефрижераторной центрифуге К-26Д) получают два слоя клеточной взвеси: нижний и верхний;
- нижний слой взвеси клеток, содержащий 98-100% нейтрофилов, аккуратно отсасывают и отмывают путем центрифугирования в среде 199 при 1500 об/мин в течение 10 мин двукратно. Полученную клеточную взвесь ресуспендируют и доводят до концентрации 5˙10⁶ клеток/мл;
- инкубируют нейтрофилы в среде 199 в течение 1 ч с активатором и без него. В качестве активатора используют взвесь полистирольного монодисперсного латекса диаметром 1,7 мкм, обладающего наибольшей активирующей способностью, не распадающегося и не разрушающего нейтрофилы. Соотношение клеток и частиц латекса равно 1: 1000. После инкубации клеточные элементы удаляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин; а частицы латекса - при повторном центрифугировании в течение 10 мин при 8000 об/мин.

Для выделения и определения молекулярной массы активных молекул супернатанта нейтрофилов последний фильтровали через фильтр Millipore диаметром 0,24 мкм и подвергали последовательной ультрафильтрации через фильтр УПМ-ПS 67000, задерживающий продукты с мол. м. свыше 10000 дальтон, и УАМ-50, пропускающий продукты и соли с мол. м. менее 500 дальтон. Полученный концентрат ультрафильтрата наносили на колонку с мелкопористым сефадексом G-15. Элюцию проводили деионизированной водой. Регистрацию выходящих пиков (фракций) осуществляли при помощи аппарата Uvicord, LKB (Швеция). Фракции суммарного супернатанта неактивированных нейтрофилов условно обозначали Н₁, Н₂, . . . , Н_n, а активированных нейтрофилов соответственно, A₁, A₂, . . . , A_n. В каждой собранной фракции определяли содержание веществ, содержащих пептидную связь, по микробиуретовому методу с помощью реактива Бенедикта спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-16, Е - 330 нм и лиофилизировали с последующим разведением до концентрации 2˙10^-4 мг/мл (альбуминового эквивалента): пептидосодержащие вещества обнаружены только во фракциях H₁, H₂, H₅, A₁, A₂, A₅.

Полученный супернатант, представляющий собой суммарный продукт секреции нейрофилов, в дальнейшем использовали для исследования его действия на психомоторную активность организма.

Исследование психотропных свойств среднемолекулярных веществ нейтрофилов человека осуществляли на мышах-самках линий CBA и F₁ (CBA x C 57 Bl) массой 20-22 г, содержащихся в идентичных условиях.

Суммарный супернатант и его фракции (Н₁, A₁ и A₅) вводили мышам внутрибрюшинно четырехкратно с интервалом 24 ч в концентрации 2˙10^-4 мг на мышь, что соответствовало количеству СМВН, полученных от 10⁵ клеток. На 5 сутки после последнего введения СМВН интактных и активированных нейтрофилов оценивали психомоторную активность животных методом актографии, предложенным М. Л. Вайшер.

Актограф представляет собой открытую камеру с 8-угольным основанием, разделенным линиями на 8 секторов, внутри которой расположен прямоугольный параллелепипед. На гранях последнего и боковых стенках самой камеры выполнены отверстия диаметром 1,5 см.

Суммарный супернатант нейтрофилов и его фракции получали у доноров и больных с переломами костей в различные сроки после травмы.

Психотропное действие среднемолекулярных веществ интактных и активированных нейтрофилов иллюстрируют следующие примеры.

П р и м е р 1. В соответствии с изложенной схемой получали суммарный супернатант неактивированных и активированных нейтрофилов у 5 доноров и вводили его интактным животным и мышам с переломом костей голени (травму наносили стандартизованно, путем механического излома костей между браншами пинцетов). Животным с переломом секреторные продукты нейтрофилов вводили через 1 сут после травмы.

Исследовали уровень психомоторной активности животных после введения секреторных продуктов активированных и неактивированных нейтрофилов человека. Результаты представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, среднемолекулярные вещества (СМВ), полученные от неактивированных нейтрофилов доноров, не оказывают влияния на психомоторную активность животных обеих групп (интактных животных и животных с травмой). В то же время введение секреторных продуктов активированных нейтрофилов доноров интактным мышам достоверно усиливает их исследовательско-ориентировочную реакцию и угнетает последнюю у животных с травмой по сравнению с мышами контрольных групп. Из этого следует вывод, что при активации нейтрофилов донора латексом ими выделяются СМВ, обладающие разносторонним психотропным действием, направление которого зависит от наличия стресса.

П р и м е р 2. Суммарный супернатант активированных и неактивированных нейтрофилов получали у 20 больных с механической травмой - перелом костей - на 4-5, 10-12, 14-16 и 20-24 сут после повреждения. Больные были схожи по возрасту, характеру и тяжести травмы, способу лечения. Секреторные продукты нейтрофилов вводили интактным животным. Исследовали уровень их психомоторной активности. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, СМВ нейтрофилов больных с травмой значительно усиливали психомоторную активность интактных животных, независимо от активации клеток латексом. При этом максимальная психомоторная активность животных наблюдается при введении супернатанта нейтрофилов, полученного у больных на 20-24 сут с момента перелома. Этот факт свидетельствует, с одной стороны, о психостимулирующем свойстве секреторных продуктов (СМВ) нейтрофилов больных с травмой и, с другой стороны, о зависимости величины их психотропного эффекта от продолжительности травматической болезни.

П р и м е р 3. Для уточнения активных молекул секреторных продуктов нейтрофилов, ответственных за ранее неизвестный для них психотропный эффект, интактным животным вводили Н₁, A₁ и A₅ фракции супернатанта нейтрофилов донора. Выбор этих фракций был обусловлен их высокой иммунотропной активностью.

Как видно из табл. 3, A₁ фракция СМВ нейтрофилов донора оказывает выраженное стимулирующее действие на психомоторную функцию организма. Отсутствие психотропной активности Н₁ фракции соотносится с действием суммарного продукта секреции неактивированных нейтрофилов, что представлено в табл. 1. Между тем, наблюдаемое нарастание психомоторной активности организма после введения суммарного супернатанта (СМВ) неактивированных нейтрофилов больных с травмой (см. табл. 2), по-видимому, обусловлено первичной активацией клеток самим повреждением.

Для изучения общих закономерностей психотропного эффекта продуктов различных видов клеток, ответственных за иммунную защиту, и для сравнения выраженности и продолжительности воздействия на психомоторную активность организма среднемолекулярных веществ нейтрофилов (заявляемый объект) с другими психостимуляторами и психодепрессантами было исследовано психотропное действие таких известных иммунопрепаратов, как Т-активин и интерлейкин-2 а также действие аминазина и кофеина (прототип).

Известные препараты вводили интактным мышам в концентрации 2˙10^-4 мг/мышь, кроме интерлейкина-2, который вводили в дозе 20 МЕ/мышь. Схема введения аналогична схеме введения СМВ нейтрофилов.

Полученные результаты представлены в табл. 4: оценивали уровень психомоторной активности интактных животных на 5-е сутки после введения им продуктов лейкоцитов и указанных психотропных препаратов.

Как видно из таблицы, на 5-е сутки только кофеин достоверно усиливал моторику животных, не влияя при этом на их исследовательско-ориентировочную деятельность. У других известных психотропных свойств на 5-е сутки нет.

Отличительной особенностью заявляемого средства является стойкость его психотропного действия - минимум 5 сут после введения (см. табл. 5) - и его разнонаправленность в зависимости от состояния организма. Последнее, в свою очередь, дает возможность применять эти вещества для целенаправленного воздействия на психомоторную функцию организма.

СМВ нейтрофилов (нейтрофилокины) могут быть использованы для создания экспериментальной модели психомоторного возбуждения организма с целью исследования влияния последнего на выживаемость организма в стрессовой ситуации. Это положение подтверждается результатами проведенного авторами эксперимента:
Мышам гибридам F₁ (CBA x C₅₇Bl) массой 14,5 ±0,72 г вводили трижды с интервалом 24 ч СМВ нейтрофилов (нейтрофилокины) A₁ в концентрации 2˙10^-4 мг на мышь. На 5 сут после введения нейтрофилокинов мышам давали плавательную физическую нагрузку до гибели животных (температура воды - 28^оС). Следует заметить, что гибель животных при плавательной нагрузке обусловлена, в первую очередь, не физической усталостью, а развитием угнетания психической функции организма, своего рода "синдрома безнадежности". Результаты исследования (табл. 5) показали, что в группе животных, которым СМВ нейтрофилов (нейтрофилокины A1) не вводили, деятельность наступала на 1,0-1,5 ч раньше, чем в группе животных, которые получали СМВ нейтрофилов (в контроле 1 вводили среду 199 в том же объеме, что и СМВ нейтрофилов).

Полученные данные свидетельствуют, с одной стороны, что данная модель позволяет изучать влияние тяжелого физического стресса на организм с повышенной психомоторной активностью, а с другой стороны, что повышение психомоторной активности путем введения нейтрофилокинов человека повышает выживаемость организма при экстремальном воздействии.

Доступность получения СМВ нейтрофилов, возможность стандартизации их по содержанию пептидов, отсутствие гетерогенности могут позволить в перспективе использовать секреторные продукты нейтрофилов в качестве актопротекторов, адаптогенов, психостимуляторов и антидепрессантов для улучшения работоспособности и повышения умственной и физической деятельности организма.

Наряду с этим, дальнейшее изучение психотропного действия продуктов секреции нейтрофилов позволит не только определить их место в процессах нейрорегуляции, но и оценить, и коррегировать последние в норме и патологии.

Результаты проведенных исследований показали, что предлагаемое средство расширяет арсенал психотропных средств; в связи с отсутствием у него гететерогенности средство более физиологично по сравнению с известными. Кроме того, среднемолекулярные вещества, выделяемые нейтрофилами человека, обладают пролонгированным действием, что исключает необходимость частых инъекций для поддержания психостимулирующего эффекта, проявляет сочетанную психо-моторную активность.

Предлагаемое психотропное средство может найти широкое применение в экспериментальной медицине. (56) Машковский М. Д. Лекарственные средства. М. : Медицина, 1977, т. 1, с. 44-48.

Авторское свидетельство СССР N 1536977, кл. G 01 N 33/53, 1987.

Зурочка А. В. , Долгушин И. И. и др. "Способ получения иммуностимулирующих нейтрофилокинов" (публикация в открытой печати запрещена).

Weischer M. -L. Eine einfache versuchsanordnung zur quantitativen Beurteilung von Motilitat und Neigier verhalten bei Mausen // Pshychopharmacology, 1976, N 50. P. 275-279.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в клинической медицине. С целью пролонгированной регуляции психомоторной активности организма в качестве психотропного средства применяют пептидсодержащую фракцию активированных нейтрофилов человека с мол. м. от 500 до 10000 дальтон. Средство обладает сочетанной психомоторной активностью. 5 табл.

Применение пептидсодержащей фракции активированных нейтрофилов человека с мол. м. 500 - 10000 дальтон в качестве психотропного средства.