Способ исследования секреторных функций нейтрофилов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

1

относится к медици1287006

де на

гии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтрофилов в норме и при различной патологии.

Целью изобретения является повышение точности исследования секреторных функций нейтрофилов человека

Поставленная цель достигается тем, что осуществляют культивирова- ние выделенных из периферической крови чистых нейтрофилов в среде 19 с активирующими .агентами или без агтов, центрифугируют клеточную взвес удаляют супернатант, с последующим использованием супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов как факторов, влияющих на- активность лейкотти тов.

Пример 1, Исследовали влил- ние секрета ней грО(1Илов, выделенных из крови доноров, на аутологичные моноциты. Для этого гранулоциты и мононуклеары выделялись из периферической крови людей путем центрифу гирования на двойном градиенте, плоность нижнего раствора фиколл-уро- траст 1,093, верхнего - 1,077. На границе между растворами образовывалось кольцо грануло1и1тов, между плазмой и верхним раствором фиколл- уротраста-мононуклеаров. После выделения клеточные суспензии отмывались средой 199. Морфологический контроль мазков, окрашенных по Романовскому- Гимзе, показал, что в верхнем слое 70-75% клеток составляли лимфоциты, 10-20% - моноциты, 5-10% гранулоциты, в нижнем кольце - 100% клеток бьши нейтрофилами.

Дпя выделения моноцитов часть мо- нонуклеаров в концентрации 10 клеток в 1 мл инкубировалась в течение 1 ч при 37 С в пробирках сапожках, на дне которых находились покровные стекла. Затем клетки, прилипшие к стеклу, отмывались от лимфоцитов средой 199 и использовались для изучения влияния супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов на лизосомальную активность, фагоцитоз моноцитов и способность последних восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ) в диформазан. Вторая часть мононуклеарных клето, не помещенных в сапожки, доводилась до, концентрации 10 клеток на 1 мл и использовалась для определения

O 5

0 5

0

5

0

действия супернатантов нейтрофилов на хемотаксис моноцитов.

Взвесь гранулоцитов из нижнего кольца разводилась средой 199 до концентрации 5-10 клеток в 1 мл и разливалась поровну в две пробирки. В 1-ю пробирку вносилась взвесь частиц латекса (из расчета 10 частиц на каждые 5-10 нейтрофилов), во вторую - такой же объем среды 199. Пробирки с гранулоцитами инкубировали в течение I ч при 37 С. Активацию нейтрофилов определяли по изменению числа лизосом. В 1-й пробирке (активированные нейтрофилы) лизо- сомальная активность 646,,76 (), во второй (нёактивированные нейтрофилы) - 459, It 19,8 (). Содержимое пробирок центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин, Супернатант использовался как хемо- атрактант, а также добавлялся в сапожки в количестве 1 мл для оценки его влияния на фагоцитарную, лизосомальную активность моноцитов, а также на реакцию восстановления этими клетками нет в диформазан.

Фагоцитарная (по захвату частиц латекса) и лизосомальная (по числу лизосом) активность оценивалась по методу И.С.Фрейдлин, реакция восстановления нет - по количеству активных клеток, содержащих гранулы, и по индексу восстановления НСТ в диформазан, хемотаксическая активность моноцитов исследовалась под агарозой по методу Р.Д.Нельсона и соавторов. Результаты представлены в табл. 1-3.

Влияние супернатанта активированных (АН) и неактивированных (НН) нейтрофилов на хемотаксис сингенных моноцитов представлено в табл. 1.

Таблица 1

0

5

Активированных нейтрофилов KiM

Неактивированных нейтрофилов

п

р

MirM п

1,346±0,044

13

:0,001 0,671±0,043

13

р

Контроль М±м (взвесь ла- текса)п

31287006 .4

Продолжение табл.1 Примечание: р- достоверность различий по отношению к контролю,

,001Влияние супернатантов АН и НН на

с фагоцитарную и лизосомальную активность сингенных моноцитов представлено в табл. 2,

0,9910,01

20

Активированных

Примечание: р- достоверность различий по отношению к контролю. Фагоцитоз определяли в отнопюнии моноциты:латекс 1:20.

Влияние супернатанта АН и НН на реакцию восстановления сингенныАктивированные М+м нейтрофилы

Неактивирован- MtM ные нейтрофилы

Таблица 2

ми моноцитами нитросинего тетразолия в диформазан представлено в табл.3,

Таблица 3,

0,873±0,139

I 1

0,01 0,429±0,089

11

Контроль

MiM

Примечание: р- достоверность различий по отношению к контролю.

М±м. п

1,542tO,l19 13 0,001

Активированные М+м нейтрофилы

Примечание: р- достоверность различий по отношению к контролю. Фагоцитоз определяли в отношении моноциты:латекс 1:100.

Продолжение табл.3

20,7512,05 12

0,,035 10

Примечание: р- досто- верность по отношению к контролю.

Влияние супернатантов АН и НН на фагоцитарную и лизосомальную активность аллогенннх моноцитов представлено в табл. 5.

Таблица 5

184,5120,62 ,75±13,42

71287006

Влияние супернатантов АН и НН на реакцию восстановления нитросинего

те ми

П р и м е р 3. Изучали влияние супернатантов активированных и не- активированных нейтрофилов рожениц с присоединившейся послеродовой инфекцией. Исследование проводилось по той же системе, что и в примерах 1. 2.

Данные влияния супернатантов АН и НН рожениц с послеродовой инфекцией на активность моноцитов доноров представлены в табл. 7.

Таблица 7

Примечай и е:р- достоверность по отношению к контролю.

8

тетразолия в диформазан аллогенны- ми моноцитами представлено в табл.6.

Таблица 6

5

0

Таким образом, из полученных нами данных видно, что нейтрофилы вы0 деляют различные вещества в суперна- тант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы продуцируют вещества, резко усиливающие функции моноцитов . У рожениц с послеродовой инфекцией отмечается резкое снижение способности нейтрофилов к синтезу активирующих моноциты веществ.

Как видно из представленных при- ;меров, предлагаемый способ исследования секреторных функций нейтрофилов позволяет изучить влияние секретов активированных и неактивирован,5 ных нейтрофилов на функциональную активность мононуклеаров человека как в аутологичном, так и в аллоген- ном сочетании, что позволяет расщи- рить представление о функциях нейтрофилов, в частности о влиянии продуктов их секреции на активность других клеток, а главное дает новый подход к оценке ранее неизученных секреторных функций нейтрофилов человека в клинической практике.

Формула изобретения

Способ исследования - секреторных функций нейтрофилов, включающий вы0

5

9128700610

деление чистой популяции нейтрофиловвацию путем внесения в среду 199

из крови, культивирование нейтрофа-взвеси частиц полистирольного латекгов на питательной среде и исследова-са диаметром 1,7 мкм или взвеси часние свойств нейтрофилов иммунологи-тиц латекса, покрытого метакриловой

ческими методами, отличаю-- 5кислотой с диаметром 1,0 мкм, далее

щ и и с я тем, что, с целью повьпне-проводят выделение супернатанта акния точности способа, в качестве пи-тивированных нейтрофилов и изучение

тательной среды используют средувлияния супернатанта на лейкоциты

199j а при культивировании нейтрофи-проводятпо способностиих восстанавлилов дополнительно проводят их акти- fOвать интросинийтетразолий вдиформазан.

Изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунологии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтро- филов в норме и при различной патологии. Целью изобретения является повьшшние точности исследования секреторных функций нейтрофилов человека путем культивирования выделенных из периферической крови чистых нейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или без агентов. Активацию нейтрофилов проводят путем внесения в среду 199 взвеси частиц полистирольного латекса, диаметром 1,7 мкм или взвеси частиц латекса, покрытого метакриловой кислотой с диаметром 1,0 мкм. Затем клеточную взвесь центрифугируют, супернатант активированных и неактивированных нейтрофилов используют для изучения влияния супернатанта на активность лейкоцитов по способности их восстанавливать нитросиний тетразолий в диформазан, а также на лизосомальную активность, фагоцитоз моноцитов.Ней- трофилы выделяют различные вещества в супернатант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы, продуцируют вещества, резко усиливающие функции моноцитов. i (/