СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии, гистохимии и цитологии кремниефильных организмов, и может быть использовано в оценке исходного материала указанных организмов, в частности риса, в лабораторной практике гистобиохимических и цитологических исследований.

Известны способы выявления кремнийсодержащих биологических структур, основанные на анализе препаратов для световой микроскопии без какой-либо специальной обработки (Алешин Е. П. , Власов В. Г. "Анатомия риса", Краснодар, ВНИИриса, 1982, с. 112, рис. 284).

Недостатками указанных способов являются:
- непригодность для идентификации неизвестных кремнийсодержащих структур, так как идентификация в них происходит только на основе уже известной морфологии;
- получаемые изображения кремнийсодержащих структур не контрастны.

Известны способы выявления кремнийсодержащих биологических структур, основанные на анализе препаратов для световой микроскопии, контрастированных фенолом.

Недостатками вышеуказанных способов являются:
- невозможность идентификации кремнийсодержащих структур неизвестной морфологии;
- невозможность выявить наличие или отсутствие кремния в биологических структурах, окремневающих в определенные периоды развития, т. е. являющихся то не окремневшими, то частично окремневшими, а то полностью окремневшими;
- дополнительные затраты времени и средств, связанные с повторными и последующими операциями по выявлению биологических кремнийсодержащих структур, ранее неизвестной морфологии, либо структур, окремневающих в определенные периоды онтогенеза.

Известен способ выявления кремнийсодержащих структур (прототип), заключающийся в том, что исследуемый биологический объект (кусочек ткани, органа и т. д. ) помещают на предметное стекло и подвергают тепловой обработке при повышенной температуре до 700^оС. При этом все биологические структуры разрушаются, исключая структуры, состоящие, по большей части, из неорганического кремнезема. Останки названных структур четко видны на предметном стекле в поле зрения микроскопа и идентифицируются абсолютно достоверно.

Недостатками способа являются:
- невозможность выявления кремнийсодержащих биологических структур в нативном состоянии, так как при высокотемпературной тепловой обработке все нативные кремнийсодержащие структуры спекаются в скелетообразные агломераты, структура которых не имеет ничего общего со структурой нативных кремнийсодержащих образований и дает характеристику лишь общего расположения последних в пределах микросподографированного биологического объекта;
- невозможность выявления кремнийсодержащих биологических структур, в которых кремний присутствует в форме кремнийорганических соединений, так как все органические соединения, в том числе составляющие клеточные стенки сложные эфиры ортосиликата и целлюлозы, разрушаются при высокотемпературной тепловой обработке и видимыми остаются только неорганические агломераты.

Целью изобретения является выявление нативного состояния кремнийсодержащих биологических структур.

Цель достигается тем, что в известном способе выявления кремнийсодержащих биологических структур, включающем тепловую обработку исследуемого биологического объекта и микроскопирование, тепловую обработку проводят в мягком режиме при 20-40^оС, а перед микроскопированием объект обрабатывают раствором препарата лектина, меченного флюоресцирующей меткой.

Подобные препараты используют в химии углеводов для специфического взаимодействия с некоторыми классами сахаров. Использование таких препаратов для выявления кремнийсодержащих структур не известно.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленный способ отличается тем, что тепловую обработку объекта проводят в мягком режиме при 20-40^оС, а перед микроскопированием его обрабатывают раствором лектина, меченного флюоресцирующей меткой. Таким образом, заявленный способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Сравнение заявленного решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области не позволило выявить в них признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию "существенные отличия" (табл. 1).

Способ поясняется фиг. 1-4.

П р и м е р 1. Реализация способа-прототипа.

Исследуемый биологический объект - цветковую чешую зерновки риса сорта Краснодарский 424 наносили на предметное стекло. Затем объект подвергали высокотемпературному тепловому воздействию, для чего выдерживали предметное стекло с объектом в муфельной печи при 700^оС в течение 30 мин. За это время органические ткани объекта разрушались и выявлялись кремнийсодержащие структуры. После этого предметное стекло с полученной микросподограммой извлекали из муфеля и, охладив до комнатной температуры, подвергали микроскопированию с помощью светового микроскопа "Биолар" (Польша). Результаты представлены на фиг. 1 и 2. Использование способа-прототипа (фиг. 1) для выявления биологических кремнийсодержащих структур, позволяет выявить общий контур кремнийсодержащего объекта. Однако использование способа-прототипа приводит к спеканию кремнийсодержащих структур в крупные агломераты, которые отчетливо видны на фиг. 1. При этом не выявляется даже тонкая структура поверхности самих этих агломератов (фиг. 2). Кроме того, полностью разрушаются кремнийсодержащие органические структуры.

П р и м е р 2. Операции выполняли как описано в примере 1. Перед микроскопированием полученную сподограмму обрабатывали стандартным препаратом соевого лектина, меченного флюоресцеирующей меткой (SBA-FDTClabelled, 20% в растворе PBS; N L-1020) (см. Biochemicals organic compounds for research and diagnostic reagents, "Sigma". USA, 1990), а затем подвергали микроскопированию на ультрафиолетовом микроскопе "Люмам И-3" (СССР). Экспериментальные результаты приведены на фиг. 3. Анализ результатов показывает, что при использовании предлагаемого способа после высокотемпературной обработки также, как и в случае использования способа-прототипа, получаются спекшиеся агломераты, однако обработка препаратом флюоресцирующего лектина позволяет рассмотреть тонкое строение поверхности выявленных микросподографированием неорганических кремнийсодержащих структур. Несмотря на выявление тонкого строения неорганических структур в данном варианте, где, как и в способе-прототипе, использовали высокотемпературную тепловую обработку, невозможно выявить органические кремнийсодержащие структуры.

П р и м е р 3. Исследуемый биологический объект - цветковую чешую зерновки риса Краснодарский 424 наносили на предметное стекло и термостатировали в термостатической камере - Komatsu Eletronics Inc. , (Япония) в мягком режиме при 30^оС в течение 30 мин (время обработки как в способе-прототипе). Затем объект обрабатывали препаратом лектина N L-1020 как описано в примере 2. После этого объект подвергали микроскопированию на ультрафиолетовом микроскопе "Люмам И-3" (СССР). Экспериментальные результаты приведены на фиг. 4.

Предлагаемый способ позволяет выявить нативное тонкое строение кремнийсодержащих биологических структур, причем выявляются кремнийорганические структуры, не разрушающиеся в отличие от способа-прототипа. В данном случае на фиг. 4 прекрасно видны флюоресцирующие кремний-целлюлозные волоски (трихомы) и тонкая организация их поверхности, а также тонкая организация продольных рядов окремневших цилиндрических клеток на поверхности чешуек. Оба названных типа структур при использовании способа-прототипа полностью разрушаются.

Исследуемый объект подвергали тепловой обработке при 20 и 40^оС. При этом тепловая обработка при 20^оС не дает необходимой повторяемости эффекта от использования флюоресцеирующих лектинов при дальнейшем микроскопировании. Обработка при 40^оС вызывает скручивание листьев и приводит к невозможности увидеть нативные структуры. Воздействие на исследуемый объект температурой 30^оС дает наиболее стабильные, повторяемые результаты, являясь оптимальным вариантом.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить нативное состояние кремнийсодержащих биологических структур, в т. ч. тех, где кремний присутствует в форме кремнийсодержащих соединений. Это, в свою очередь, позволяет вести работы по направленной оценке гистологических и цитологических процессов у кремниефильных организмов, по использованию морфологии выявляемых кремнийсодержащих структур в систематике и селекции; по их роли в формировании урожая; в устойчивости и т. д. Заявляемый способ достаточно прост, требующиеся для его осуществления материалы доступны в любой биохимической лаборатории. (56) Loshida Sh. "Laboratory Manual forphysiological Studies of rice. 2-nd ed. The 2RR2. Manila, 1972, p. 72.

Прозина М. Н. Ботаническая микротехника. М. : Высшая школа, 1960.

Использование: биохимия, гистохимия и цитология кремниефильных организмов. Сущность изобретения: препарат биологического объекта подвергают тепловой обработке в мягком режиме при 20 - 40С, обрабатывают препаратом флюоресцирующего лектина и микроскопируют. 4 ил. , 1 табл.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КРЕМНИЙСОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР, включающий тепловую обработку препарата биологического объекта и микроскопирование, отличающийся тем, что тепловую обработку проводят при 20 - 40^oС, а перед микроскопированием объект обрабатывают препаратом флюоресцирующего лектина.