СПОСОБ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НАТИВНОГО СОСКОБА КОРНЯ ЯЗЫКА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано в стоматологии, терапии, педиатрии, дерматологии.

Микрофлора полости рта является важной составляющей, необходимой для здоровья человека. В настоящее время известно, что с изменением качественного и количественного состава микробиома полости рта связано развитие кариеса, специфических и неспецифических воспалительных процессов полости рта, многих заболеваний, включая неврологические и сердечно-сосудистые (Боровский Е.В., Машкиллейсон А.Л. Заболевания слизистой оболочки полости рта и губ. - М.: Медицина, 1994. - 297 с; Терапевтическая стоматология: национальное руководство /под ред. Проф. Л.А. Дмитриевой, проф. Ю.М. Максимовского «ГЭОТАР - Медиа», 2009. - 912 с; Янушевич О.О., Гринин В.М., Почтаренко В.А., Рунова Г.С. Заболевания пародонта. Современный взгляд на клинико-диагностические и лечебные аспекты/ под ред. О.О. Янушевича. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 160 с). Однако использование микроскопических методов исследования как клинической лабораторной диагностики заболеваний полости рта, ограничено. В последние годы предпочтение отдается культуральным/микробиологическим методам исследования микрофлоры полости рта из патологического очага (Николаев А.И., Цепов Л.М. Практическая терапевтическая стоматология. - М.: МЕДпресс-информ, 2010. - 924 с).

Но недостатком культурального/микробиологического исследования микрофлоры полости рта является:

- его высокая стоимость;

- трудоемкость методики;

- невыполнение правил забора и транспортировки биологического материала снижает качество результатов;

- требование создания как аэробных, так и анаэробных условий культивирования увеличивает стоимость расходных материалов;

- наличие в составе микроорганизмов полости рта трудно культивируемых и некультивируемых форм не позволяет выделять их и изучать свойства.

Кроме того, с целью диагностики и профилактики заболеваний внедряются новые молекулярно-генетические методы исследования микрофлоры полости рта: ПНР, секвенирование, генотипирование.

Но недостатком их является:

- доступность метода в крупных и хорошо оснащенных центрах, НИИ;

- высокая стоимость оборудования и расходных материалов;

- значительная затрата времени на исследование;

- требование высокой квалификации обученного персонала.

Известны способы микроскопического исследования окрашенных препаратов соскоба слизистой оболочки спинки языка, применяемые в стоматологии для диагностики лептотрихиоза полости рта (Боровский Е.В., Чумаков А.А., Миренова Л.Г. Диагностика и лечение лептотрихоза слизистой полости рта: методические рекомендации. - М.: ММСИ имени Н.А. Семашко, 1987. - 4 с). По данной методике берут соскоб металлическим стоматологическим инструментом/шпателем и наносят на предметное стекло. После высушивания на воздухе 20 минут проводится фиксация мазка смесью Никифорова 20-30 минут. На высушивание и окрашивание по Романовскому-Гимзе официнальной смесью азура и эозина требуется 40 минут. Дальнейшее промывание и высушивание - 20 минут и микроскопия с увеличением ×40, затем ×100.

Но недостатком этого микроскопического метода исследования окрашенного мазка из флоры полости рта является:

- затраты времени на фиксацию, окрашивание и высушивание мазка не менее 120 минут;

- недоступность эфира для приготовления смеси Никифорова;

- использование одного предметного стекла снижает качество приготовления мазка заданной толщины;

- невозможность морфологической дифференциации химической структуры клеточной стенки, то есть принадлежности микроба к грам+ или грам- бактериям;

- необходимость делать соскоб с языка в кабинете стоматолога специальными инструментами.

Известен также негативный способ микроскопического исследования соскоба слизистой оболочки спинки языка, других слизистых полости рта, применяемый в дерматологии для лабораторной диагностики лептотрихиоза и грибковой инфекции полости рта (Клиническая дерматовенерология: в 2 т. / под ред. Ю.К. Скрипкина, Ю.С. Бутова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т.1. - 720 с.). Делают соскоб с языка металлическим шпателем, наносят на предметное стекло, не высушивая, смешивают с каплей 10% раствора щелочи - КОН (калиевой) или NaOH (натриевой) и накрывают покровным стеклом. Препарат немедленно изучают под микроскопом с увеличением ×10 и ×40.

Но недостатком этого микроскопического метода исследования неокрашенного мазка флоры полости рта является:

- изучение микрофлоры в соскобе возможно не более 10 минут после смешивания с щелочью, в дальнейшем микробы в препарате разрушаются, утрачивая морфологию, искажая микроскопическую картину;

- для исследования доступна только форма микробной клетки и количество микроорганизмов в поле зрения;

- преимущественно используется для изучения клеток грибов, которые не разрушаются под действием щелочи, а не множества представителей бактериального мира;

- щелочь разрушает связи между бактериями, невозможно составить представление о взаимодействии бактерий в микробиоме;

- невозможность дифференциации бактерий по химической структуре клеточной стенки, то есть принадлежности микроба к грам+ или грам- бактериям;

- щелочь разрушает эпителий, что делает невозможным исследование в соскобе эпителиальных клеток ни по количеству, ни по структуре;

- консультирование по спорным результатам микроскопии возможно проводить только непосредственно во время исследования; невозможно вернуться к изучению препарата на следующий день или позже.

Специфическим маркером баланса симбиотических отношений макроорганизма и микроорганизмов микрофлоры тела человека считают состояние его микробиомов (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко Е.М. Экология микроорганизмов / под ред. Проф. А.И. Нетрусова. - М.: Академиа, 2004. - 272 с.), которое коррелирует с потреблением питательных веществ, отражает различные физиологические состояния макроорганизма и показывает изменение иммунного статуса.

Задача - предложить способ микроскопического исследования нативного соскоба со слизистой корня языка, лишенный вышеперечисленных недостатков.

Технический результат состоит в возможности выявления количества микроорганизмов микробиома полости рта, их химической принадлежности по строению клеточной стенки к грамнегативным или грампозитивным бактериям, морфологии, пространственного расположения, коадгезии между собой и гистадгезии к клеткам эпителия, путем применения сложной дифференциальной окраски фиксированного мазка из глубокого соскоба корня языка, содержащего основных представителей микробиома, методом Грама.

Технический результат достигается тем, что в качестве биоматериала для микроскопии используется глубокий соскоб корня языка, который берут на границе задней трети спинки и корнем языка стерильным деревянным шпателем, с усилием надавливая на слизистую. Забранный в количестве 0,5 мл нативный биоматериал наносится шпателем поочередно на два сухих стерильных предметных стекла и равномерно распределяется на каждом стекле площадью около 1,5-2 см² в пределах круга-метки. Препараты высушиваются на воздухе 20 минут, фиксируются мазками вверх в пламени спиртовки непрерывно 5-6 секунд и окрашиваются сложным дифференциальным методом Грама (Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие / под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. - М.: Медицина, 2004. - 576 с. / с. 93-94). Метод датского бактериолога Ханса Христиана Грама включает последовательное окрашивание фиксированного мазка карболовым генцианвиолетом, обработку раствором Люголя, обесцвечивание спиртом, промывание водой и докрашивание водно-спиртовым раствором фуксина. Используют приготовленные по рецептуре красители и/или набор реагентов для окраски по Граму производителя ЗАО ЭКОлаб ТУ 9389-083-70423725-2007, РУ ФСР 2008/03335 от 23.09.08.

Результаты оценивают следующим образом: окрашенные по Граму мазки на двух предметных стеклах исследуются под биологическим микроскопом с иммерсией, используется объектив иммерсионный ×100 и окуляр ×15 (см. фото 1-4).

Методом случайной выборки нами было обследовано 2700 человек разного пола, национальности, социального положения и возраста - дети от 1 года и взрослые люди до 87 лет. У всех исследуемых установлен микроскопический статус соскоба корня языка: микроскопическим методом определены количественное содержание бактерий в 0,5 мл соскоба, принадлежность к грам+ или грам- бактериям, морфология и размеры бактерий, наличие бактерий, схожих с лептотрихиями, и грибов, схожих с кандидами, коэффициенты коадгезии и гистадгезии, количество и характеристика клеток и ядер эпителия.

Результаты представлены в таблице 1.

При анализе данных, представленных в таблице 1, видно, что применение способа микроскопии нативного соскоба корня языка, окрашенного методом Грама, объективно характеризует как качественный, так и количественный состав микробиома полости рта в его естественном состоянии, включая клетки эпителия слизистой корня языка.

Преимущества предложенного способа:

- в качестве метода клинической лабораторной диагностики способ полностью раскрывает картину биопленок/взаимодействия бактерий между собой и состояния эпителия;

- способ не инвазивен и безопасен для пациента;

- для получения результата о составе микробиома требуется 30 минут;

- предложенный способ может быть применен в любом лечебном учреждении, в амбулаторных условиях кабинета любого специалиста;

- фиксированные мазки можно доставлять и окрашивать в баклаборатории стандартным методом Грама; не требует специально обученного персонала;

- способ может использоваться при проведении мероприятий по скрининг-диагностике состояния микробиома полости рта;

- может явиться профилактическим методом в группах риска по заболеванию кариесом зубов и патологии желудочно-кишечного тракта.

Пример 1

Аркадий Г., 19 лет. Практически здоров. Содержание бактерий в соскобе с языка умеренное, преобладают грампозитивные кокки, имеются грамнегативные диплококки, что соответствует норме микробиома. Лептотрихии единичные в поле зрения микроскопа, длиной до 15 мкм, клеток грибов не обнаружено. Клетки эпителия типичные, 0-1 в поле зрения, с хорошо структурированным ядром, коэффициент гистадгезии умеренный, коадгезия микроорганизмов между собой невысокая.

Пример 2

Марина Д., 51 год. Диагноз: красный плоский лишай. Сахарный диабет II типа. В соскобе с языка большое количество микроорганизмов, которые располагаются скоплениями по типу «шаров», преобладают грамнегативные кокки и палочки. Лептотрихии до 20-30 в каждом поле зрения, длина их до 40 мкм, имеются ложные гифы грибов до 3-5 в поле зрения. Эпителий разрушен, 8-10 в поле зрения, множество ядер, коэффициент гистадгезии высокий, коадгезия микроорганизмов между собой очень высокая.

Таблица 1 Микроскопическое исследование соскоба корня языка (M±n) Группы (n=100) Выявление разницы в строении клеточной стенки бактерий (грам+ и грам-) Выявление клеток эпителия и ядер Выявление гистадгезии (бактерии на поверхности клеток эпителия) Выявление коадгезии (склеивание бактерий между собой) (абс.иссл.) (абс.иссл.) (абс.иссл.) (абс.иссл.) Исследуемая группа (метод Грама) 100,0 98,0±2,0 100,0 96,0±1,8 Контрольная группа (метод Романовского - Гимзы) 0,0 88,0±1,8 68,0±2,8 76,0±2,7 Группа сравнения (негативный метод - 10% КОН) 0,0 0,0 0,0 0,0 *(M±m)

Т.о. предлагается способ микроскопического исследования нативного соскоба слизистой корня языка, включающий забор материала стерильным шпателем, приготовление мазка на предметном стекле, высушивание, фиксацию мазка и его окрашивание, микроскопию с иммерсией и объектив ×100, отличающийся тем, что для исследования забирают 0,5 мл биоматериала из глубокого соскоба со слизистой на границе задней трети спинки и корня языка, готовят два мазка на двух предметных стеклах площадью 1,5-2,0 см² каждый, далее мазки высушивают на воздухе 20 минут, фиксируют жаром в пламени спиртовки в течение 5-6 секунд, окрашивают сложным дифференциальным методом Грама, просматривают не менее 10 полей зрения на каждом стекле, подсчитывают общее количество микроорганизмов, коэффициенты коадгезии и гистадгезии, пространственное расположение бактерий, преобладание грам+ или грам- бактерий, наличие бактерий, схожих с лептотрихиями, геликобактерами, наличие ложных гиф грибов, количество и состояние клеток и ядер эпителия.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу микроскопического исследования нативного соскоба слизистой корня языка. Сущность способа состоит в том, что деревянным шпателем забирают 0,5 мл биоматериала из глубокого соскоба со слизистой на границе задней трети спинки и корня языка, готовят два мазка на двух предметных стеклах площадью 1,5-2,0 см², мазки высушивают 20 минут, осуществляют фиксацию мазка жаром в пламени спиртовки непрерывно в течение 5-6 секунд, окрашивают сложным дифференциальным методом Грама, микроскопируют с иммерсией при объективе х100, просматривают не менее 10 полей зрения на каждом стекле, учитывая количественные и качественные характеристики микроорганизмов, клеток и ядер эпителия. Изобретение позволяет осуществить более точное исследование нативного соскоба c языка. 4 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ микроскопического исследования нативного соскоба слизистой корня языка, включающий забор материала стерильным шпателем, приготовление мазка площадью 1,5-2,0 см² на предметном стекле, высушивание на воздухе 20 минут, фиксацию мазка жаром в пламени спиртовки и его окрашивание сложным дифференциальным методом Грама, микроскопию с иммерсией и объектив ×100, отличающийся тем, что для исследования деревянным шпателем забирают 0,5 мл биоматериала из глубокого соскоба со слизистой на границе задней трети спинки и корня языка, готовят два мазка на двух предметных стеклах, далее мазки высушивают и фиксируют жаром в пламени спиртовки непрерывно в течение 5-6 секунд, окрашивают, просматривают не менее 10 полей зрения на каждом стекле, учитывая количественные и качественные характеристики микроорганизмов, клеток и ядер эпителия.