СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ ФАГОЦИТОЗА У ДЕТЕЙ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики нарушения фагоцитоза у детей при различных заболеваниях.

Известен способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов у больных и здоровых людей [Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунология и иммунопатология заболеваний легких. - Киев: Здоров'я, 198]. - с. 169], согласно которому берут кровь у пациента, в пробирку с антикоагулянтом, смешивают ее с объектом фагоцитоза, в качестве которого используются частицы значительно меньшего диаметра, чем лейкоциты, например, микробы, инкубируют смесь крови и объектов фагоцитоза в термостате, пробирку центрифугируют и делают мазки, Мазки окрашивают, под микроскопом просматривают 100 лейкоцитов (общее число лейкоцитов) и подсчитывают общее число поглощенных лейкоцитами микробов. Производят расчет показателей фагоцитоза, в качестве которых используют 2 показателя:

1. Процент фагоцитирующих лейкоцитов, т.е. количество лейкоцитов из 100, проявивших фагоцитарную активность (фагоцитировавших один и более объектов фагоцитоза).

2. Фагоцитарное число, т.е. число микробов, поглощенных в среднем одним лейкоцитом.

Для здоровых лиц процент фагоцитирующих лейкоцитов составляет 50-70%, а фагоцитарное число - 2,0-4,0. При снижении одного или обоих показателей делают вывод о нарушении фагоцитоза.

Недостатком аналога является невозможность оценить защитную функцию лейкоцитов крови в отношении более крупных частиц, превышающих диаметр лейкоцитов крови, т.к. в качестве объектов фагоцитоза используются частицы (микробы, дрожжи, частицы латекса), с заведомо меньшим диаметром, чем лейкоциты, т.к. лейкоциты неспособны фагоцитировать частицы большого диаметра. Диаметр фагоцитирующих лейкоцитов составляет от 12-14 μм у нейтрофилов (WhiteBloodcells - TheHistologygide - UniversityofLeeds. https://hisyology.leeds.ac.uk) до 16-22 μмумоноцитов (Monoytes - an overview (https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/monocyte). В организм человека, в частности, в дыхательные пути, могут попадать относительно крупные частицы, которые лейкоциты неспособны фагоциторовать и которые могут нанести вред здоровью человека. Чем крупнее частицы, тем легче они выводятся из организма человека.(Particles in the air and their effects on our health, https://www.mfe.govt.nz/air/specific-air-pollutants/particles).

Известен способ диагностики нарушения фагоцитоза (Нишева Е.С., Каган А.В., Акопян А.С. Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей патент РФ RU 2512776 C1), согласно которому исследуют взвесь лейкоцитов и частиц, содержащих хемоаттрактанты для лейкоцитов, в качестве которых использовали нативные зерна пыльцы тимофеевки, при соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу, взвесь наносят на предметное стекло, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, до инкубации, инкубируют взвесь при горизонтальном положении предметного стекла, определяют количество частиц, присоединивших лейкоциты, после инкубации и при количестве частиц менее 32% до инкубации или менее 60% после инкубации диагностируют нарушение фагоцитоза.

Недостатком аналога является оценка только хемотаксических и адгезионных функций лейкоцитов, способ предусматривает инкубацию лейкоцитов и частиц-объектов фагоцитоза в виде монослоя, препятствующего контакту лейкоцита с несколькими частицами одновременно, что не позволяет выявить новое, открытое нами, свойство лейкоцитов склеивать в агломераты и удерживать вместе крупные частицы, превышающие диаметр лейкоцитов. Этот способ является ближайшим аналогом и принят за прототип.

Технический результат изобретения состоит в повышении точности способа за счет обеспечения оптимальных условий для выявления нарушений особой, впервые выявленной нами, функции лейкоцитов склеивать и удерживать крупные, превышающие диаметр лейкоцита, частицы, а также простоте выполнения и минимальных временных затратах.

Указанный технический результат достигается в способе диагностики нарушения фагоцитоза у детей, включающем исследование смеси лейкоцитов и частиц, превышающих размеры лейкоцитов, в соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу, инкубацию смеси в термостате, ресуспендирование и микроскопирование, отличающийся тем, что смесь вносят в пробирку, которую инкубируют в вертикальном положении при 37°С в течение 1 часа, определяют процент частиц, склеенных лейкоцитами в агломераты, от общего количества частиц, свободно лежащих и склеенных в агломераты, и при количестве частиц в агломератах менее 40% диагностируют нарушение фагоцитоза.

Способ иллюстрируется фиг. 1, 2, где представлены фотографии склеенных лейкоцитами зерен пыльцы.

Склеивание зерен пыльцы осуществляется именно лейкоцитами, а не плазмой крови, что определялось нами в отдельных экспериментах, когда бесклеточная плазма крови инкубировалась с зернами пыльцы и агломерации зерен пыльцы не происходило.

Время инкубации определено опытным путем: при сокращении срока инкубации, а также при его увеличении либо уменьшаются различия между опытной и контрольной группами пациентов, либо учет реакции становится невозможным, например, при увеличении срока инкубации до 24 часов лейкоциты склеивают большинство зерен пыльцы в единый агломерат, разбить который путем пипетирования невозможно.

Из табл. 1 видно, что с помощью заявленного способа нарушения фагоцитоза выявлены у подавляющего большинства детей с заболеваниями, в патогенезе которых предполагаются дефекты фагоцитарного звена иммунитета: хронические бронхолегочные заболевания, плохое заживление ран, рецидивирующий фурункулез, рецидивирующие абсцессы мягких тканей, хронический пародонтит, хроническая носоглоточная инфекция.

При обследовании детей использовался широкий набор иммунологических методов обследования, в том числе показателей фагоцитоза микробов, теста с нитросинимтетразолием, показателей окислительного взрыва лейкоцитов, показателей хемотаксиса лейкоцитов, а также показателей, косвенно влияющих на процессы фагоцитоза, таких как уровень иммуноглобулинов и комплемента в сыворотке крови.

У большинства пациентов с заболеваниями, в патогенезе которых нарушений фагоцитоза обычно не обнаруживается (острая респираторная вирусная инфекция, переломы костей, неущемленные грыжи, сколиоз) не выявлено нарушений фагоцитоза с помощью заявленного способа.

У единичных больных из этой группы выявлены нарушения фагоцитоза - у одного больного с острой респираторной вирусной инфекцией, одного пациента с паховой грыжей и двух пациентов со сколиозом. При подробном сборе анамнеза оказалось, что эти пациенты имели сопутствующие хронические заболевания, которые ассоциируются с дефектами фагоцитарной системы: у пациента с острой вирусной инфекцией в анамнезе был рецидивирующий фурункулез, у пациента с паховой грыжей, у двух пациентов со сколиозом был хронический тонзиллит, при котором также возможны дефекты фагоцитарной системы.

В табл. 2 представлено сопоставление частоты выявлений нарушения фагоцитоза с помощью заявленного изобретения и способа - прототипа.

Из табл. 2 видно, что с помощью заявленного изобретения нарушения фагоцитоза выявлялись достоверно чаще, чем с помощью способа-прототипа.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

У пациента берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную градуированную пластиковую небольшую пробирку (100 ед гепарина на 1 мл крови). В качестве пробирок используют градуированные эпиндорфы объемом 1-1,5 мл. Для проведения исследования у большинства пациентов достаточно 0,2 мл крови, у пациентов с нейтропенией: 0,4-0,5 мл крови для исследования. Пробирку с кровью оставляют на 1 час при комнатной температуре для спонтанного осаждения эритроцитов, при этом над осадком эритроцитов образуется слой плазмы, содержащий лейкоциты. Производят подсчет лейкоцитов в плазме, для этого отбирают из пробирки 10 мкл плазмы с лейкоцитами и смешивают ее со 190 мкл 3% водного раствора уксусной кислоты, заполняют полученной смесью камеру Горяева и определяют концентрацию лейкоцитов общепринятым способом. Образцы плазмы крови, содержащие 3-9×10⁹ лейкоцитов/л пригодны для исследования сразу, а образцы плазмы крови, содержащие менее 3×10⁹ лейкоцитов/л или более 9×10⁹ лейкоцитов/л, подвергают дополнительной обработке, чтобы стандартизовать количество лейкоцитов.

Образцы крови, в плазме которой содержится менее 3×10⁹ лейкоцитов/л в приготовленном для подсчета препарате, центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин (перед центрифугированием плазму не отсасывают в отдельную пробирку, а оставляют на осадке эритроцитов, чтобы избежать травматизации лейкоцитов о стенки пробирки при центрифугировании). После центрифугирования лейкоциты оседают на поверхность эритроцитов, над ними образуется слой плазмы без лейкоцитов, лишний объем плазмы удаляют, ресуспендируют кровь путем прокручивания пробирки между ладонями, оставляют пробирку на 1 час и после оседания эритроцитов и образования взвеси плазмы с лейкоцитами кровь исследуют.

Количество плазмы, которую нужно удалить, рассчитывают следующим образом.

Например, исходно у пациента в плазме 1,5×10⁹ лейкоцитов/л. После центрифугирования в пробирке с кровью плазмы содержится 0,2 мл (определяется по градуировке на стенке пробирки). Из пробирки нужно удалить 0,1 мл плазмы, чтобы увеличить количество лейкоцитов до количества, не менее 3×10⁹ лейкоцитов/л.

Образцы плазмы крови, содержащие более 9×10⁹ лейкоцитов/л, разводят собственной плазмой пациента. Для этого взвесь лейкоцитов с плазмой отсасывают в отдельную пробирку, перемешивают и половину содержимого переносят во вторую пробирку. Вторую пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин, отсасывают плазму и этой плазмой разводят лейкоциты в первой пробирке до необходимого уровня.

Готовят взвесь пыльцевых зерен тимофеевки следующим образом. Пыльцевые зерна разводят физиологическим раствором до такой концентрации, чтобы при смешивании плазмы крови с лейкоцитами и взвеси пыльцевых зерен в равных количествах, на 5-30 лейкоцитов пациента приходилось 1 пыльцевое зерно. Взвесь пыльцевых зерен готовят следующим образом - пыльцевые мешки от одного колоска тимофеевки, собранного в период цветения растения, разводят в 0,4-0,5 мл физиологического раствора и интенсивно пипетируют 20-30 секунд для отделения зерен пыльцы от пыльцевых мешков. Определяют концентрацию зерен пыльцы в растворе с помощью камеры Горяева аналогично определению концентрации лейкоцитов. Разводят полученную взвесь зерен пыльцы таким образом, чтобы концентрация зерен пыльцы была в 5-30 раз меньше, чем количество лейкоцитов у данного пациента. Например, исследуется кровь пациента А. При отстаивании его крови в течение 1 часа получена плазма с концентрацией лейкоцитов 4,5×10⁹/л. При приготовлении раствора пыльцевых зерен в исходном растворе их концентрация составила 1,8×10⁹/л. Этот исходный раствор нужно развести по крайней мере в два раза, тогда концентрация пыльцевых зерен в нем составит 0,9×10⁹/л и при смешивании равных объемов плазмы с лейкоцитами пациента А и взвеси зерен пыльцы соотношение между лейкоцитами и зернами пыльцы составит 5:1.

Полученную взвесь исследуют под микроскопом - 25 мкл взвеси зерен пыльцы помещают на предметное стекло и накрывают ее покровным стеклом 24×24 мм, края которого смазаны вазелином для предотвращения испарения и вытекания исследуемой жидкости. Полученный на стекле препарат рассматривают под микроскопом (увеличение окуляра х15, объектива х25). Подсчитывают количество зерен пыльцы в 10 полях зрения и определяют среднее количество зерен пыльцы в одном поле зрения. Оптимальной является концентрация зерен пыльцы, когда в одном поле зрения видно 2-4 пыльцевых зерна, тогда при смешивании с лейкоцитами на 10-30 лейкоцитов пациента будет приходиться 1-2 пыльцевых зерна (5-30 лейкоцитов на 1 частицу).

Для оценки фагоцитоза в отдельную пробирку вносят 50 мкл плазмы крови пациента с лейкоцитами, добавляют 50 мкл рабочего раствора пыльцевых зерен, смесь осторожно перемешивают пипетированием и инкубируют в термостатате при 37°С в течение 1 часа. По окончании инкубации пробирку извлекают из термостата, пипетируют смесь не менее 3 раз и наносят 50 мкл смеси на предметное стекло, накрывают смесь покровным стеклом 24×24 мм, края которого смазаны вазелином и микроскопируют препарат (объектив х25, окуляр х15). Подсчитывают суммарно не менее 100 зерен пыльцы, свободно лежащих и склеенных между собой, одновременно отдельно учитывают количество зерен пыльцы, находящихся в агломератах, то есть склеенных между собой. При микроскопии между склеенными зернами пыльцы обычно видны лейкоциты, склеивающие их. На фиг. 1 представлены фотографии склеенных лейкоцитами зерен пыльцы.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Мальчик 14 лет направлен в стационар с диагнозом хроничский бронхит. Из анамнеза известно, что с грудного возраста ребенок болеет частыми бронхитами (3-4 раза в год). Бронхиты сопровождаются субфебрильной температурой тела, нарушением общего самочувствия, воспалительными изменениями в анализах крови, свидетельствующими о течении бактериальной инфекции. Улучшение состояния ребенка в большинстве случаев наступает после курса антибактериальной терапии. При клинико-лабораторном обследовании исключены врожденные иммунодефицита, врожденные заболевания и пороки развития бронхолегочной системы, аспирация инородного тела и прочее. Уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс, тест с нитросинимтетразолием, показатели окислительного взрыва лейкоцитов, показатели хемотаксиса лейкоцитов были в пределах возрастной нормы.

Произвели исследование заявляемым способом. Приготовили взвесь лейкоцитов и пыльцевых зерен тимофеевки в соотношении 5 лейкоцитов на 1 зерно пыльцы тимофеевки.

При микроскопировании выявлено: количество пыльцевых зерен тимофеевки, склеенных лейкоцитами, то есть, находящихся в агломератах, после инкубации смеси в термостате составило 28%. Сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.

Пример 2. Девочка 1 год 2 месяца обследована в иммунологической лаборатории из-заплохого заживления послеоперационных ран. В период новорожденности у девочки диагностирована атрезия пищевода, по поводу которой неоднократно оперирована: наложение гастростомы, пластика пищевода). Послеоперационный период осложнялся несостоятельностью швов, плохим заживлением послеоперационных ран. Требовалась длительная многонедельная терапия с использованием дорогостоящих препаратов для улучшения состояния ребенка.

При клинико-лабораторном обследовании девочки показатели сахара крови, уровень Т- и В-лифоцитов, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс, тест с нитросинимтетразолием, показатели окислительного взрыва лейкоцитов, показатели хемотаксиса лейкоцитов были в пределах возрастной нормы.

Произвели исследование заявляемым способом. Приготовили взвесь лейкоцитов и пыльцевых зерен тимофеевки в соотношении 15 лейкоцитов на 1 зерно пыльцы тимофеевки.

При микроскопировании выявлено: количество пыльцевых зерен тимофеевки, находящихся в агломератах, т.е. склеенных лейкоцитами, после инкубации смеси составило - 18%. Сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данной пациентки.

Пример 3. Девочка 3 месяцев госпитализирована в стационар с рецидивом абсцесса мягких тканей. Из анамнеза известно, что в возрасте 12 дней госпитализирована с абсцессом правой половой губы, получала антибактериальную терапию, хирургическое дренирование абсцесса, выписана через 11 дней. В возрасте 1,5 месяцев вновь госпитализирована с абсцессом левой половой губы, получала лечение, выписана через 10 дней. В возрасте 3 месяцев снова госпитализирована с абсцессом левой половой губы.

При клинико-лабораторном обследовании ребенка показатели сахара крови, уровень сывороточных иммуноглобулинов, комплемента, фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс, тест с нитросинимтетразолием, показатели окислительного взрыва лейкоцитов, показатели хемотаксиса лейкоцитов были в пределах возрастной нормы.

Исследование фагоцитоза проводилось как с пыльцевыми зернами тимофеевки, так и с пыльцевыми зернами ежовника обыкновеннго, лайма мелколистного, бирючины обыкновенной.

При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами тимофеевки с помощью заявленного способа выявлено снижение агрегации (склеивания) пыльцевых зерен лейкоцитами до 16%, на основании чего сделано заключение о нарушении фагоцитоза у данного пациента.

При исследовании показателей фагоцитоза с пыльцевыми зернами других растений также выявлены значительное снижение агрегации зерен пыльцы лейкоцитами пациентки: с пыльцой ежовника обыкновенного процент склеенных лейкоцитами частиц составлял 14%, лайма мелколистного - 17%, бирючины обыкновенной - 19%.

Таким образом, пыльца других растений также может быть использована в качестве частиц, которые могут склеивать лейкоциты, при; диагностике нарушений фагоцитоза с помощью заявленного способа.

Заявленный способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей позволяет в большинстве случаев повысить точность исследования по сравнению с прототипом (при ряде заболеваний - до 100%), не требует специального оборудования, может быть использован в любой клинической лаборатории у пациентов с различными заболеваниями для выявления нарушений фагоцитоза. Постановка и учет реакции с помощью заявленного способа занимает 10-15 минут, время инкубации в термостате, занимающее 1 час, может быть использовано лаборантом для проведения других исследований.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики нарушения фагоцитоза у детей при различных заболеваниях. Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей осуществляют путем исследования смеси, состоящей из взвеси лейкоцитов в плазме крови и взвеси пыльцевых зерен в физиологическом растворе, при этом исследование включает приготовление образца плазмы крови, содержащего 3-9×10⁹ лейкоцитов/л, расчет количества плазмы, которое нужно удалить; приготовление взвеси частиц, выбранных из пыльцевых зерен тимофеевки, ежовника обыкновенного, лайма мелколистного, бирючины обыкновенной, превышающих размеры лейкоцитов и способных склеивать лейкоциты, определение концентрации пыльцевых зерен, исследование полученной взвеси частиц под микроскопом, подсчет количества зерен пыльцы в 10 полях зрения и определение среднего количества зерен пыльцы в одном поле зрения, смешивание взвеси лейкоцитов и зерен пыльцы в равных частях. Оценку фагоцитоза осуществляют путем подсчета суммарно не менее 100 зерен пыльцы в соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу, инкубацию смеси в термостате, ресуспендирование и микроскопирование. При этом смесь вносят в пробирку, которую инкубируют в вертикальном положении при 37°С в течение 1 часа, подсчитывают суммарно не менее 100 зерен пыльцы, свободно лежащих и склеенных между собой с одновременным учетом количества зерен пыльцы, находящихся в агломератах, определяют процент частиц, склеенных лейкоцитами в агломераты, от общего количества частиц, свободно лежащих и склеенных в агломераты, и при количестве частиц в агломератах менее 40% диагностируют нарушение фагоцитоза. Изобретение обеспечивает повышение точности способа за счет обеспечения оптимальных условий для выявления нарушений функции лейкоцитов склеивать и удерживать крупные, превышающие диаметр лейкоцита частицы. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ диагностики нарушения фагоцитоза у детей путем исследования смеси, состоящей из взвеси лейкоцитов в плазме крови и взвеси пыльцевых зерен в физиологическом растворе, при этом исследование включает приготовление образца плазмы крови, содержащего 3-9×10⁹ лейкоцитов/л, расчет количества плазмы, которое нужно удалить; приготовление взвеси частиц, выбранных из пыльцевых зерен тимофеевки, ежовника обыкновенного, лайма мелколистного, бирючины обыкновенной, превышающих размеры лейкоцитов и способных склеивать лейкоциты, определение концентрации пыльцевых зерен, исследование полученной взвеси частиц под микроскопом, подсчет количества зерен пыльцы в 10 полях зрения и определение среднего количества зерен пыльцы в одном поле зрения, смешивание взвеси лейкоцитов и зерен пыльцы в равных частях, оценку фагоцитоза путем подсчета суммарно не менее 100 зерен пыльцы в соотношении 5-30 лейкоцитов на 1 частицу, инкубацию смеси в термостате, ресуспендирование и микроскопирование, отличающийся тем, что смесь вносят в пробирку, которую инкубируют в вертикальном положении при 37°С в течение 1 часа, подсчитывают суммарно не менее 100 зерен пыльцы, свободно лежащих и склеенных между собой с одновременным учетом количества зерен пыльцы, находящихся в агломератах, определяют процент частиц, склеенных лейкоцитами в агломераты, от общего количества частиц, свободно лежащих и склеенных в агломераты, и при количестве частиц в агломератах менее 40% диагностируют нарушение фагоцитоза.