СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИЕМИИ И СЕПСИСА Российский патент 1994 года по МПК G01N33/49 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может найти применение при дифференциальной микробиологической диагностике бактериемии и сепсиса.

Известны способы микробиологической диагностики бактериемии и сепсиса, предусматривающие посев крови на жидкие транспортно-диагностические среды (методические рекомендации "Тактика микробиологического обследования больного с подозрением на сепсис". Министерство здравоохранения СССР, М. , 1989, с. 14).

Чувствительность известных способов по данным разных авторов колеблется от 22,5 до 87,5% и во многом зависит от удачного выбора сред культивирования, обеспечивающих рост широкого спектра возбудителей. Проведение многократных посевов крови до 6-8 раз в течение 1-2 суток повышает результативность исследования.

При отсутствии роста предварительный отрицательный ответ выдается через 2-3 суток, окончательный - через 12-14 суток.

Известные способы не являются достаточно точными, так как позволяют выявить в крови только классические формы бактерий, в то время как их варианты, дефектные по клеточной стенке (ДКС), они не выявляют.

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ диагностики бактериемии и сепсиса, позволяющего выявить в крови бактерий ДКС, при котором исследуемые образцы крови после отделения элементов крови, подвергают гепаринизации, лизированию в 0,25% стерильном гипотоническом растворе, фильтруют через фильтр 0,22 μ, инокулируют в агар (VA) и жидкую питательную среду (VB) в конечном разведении 1: 100, 1: 500, 1: 1000, 1: 10000, инкубируют и, начиная со 2-3 суток, посевы микроскопируют (Dominigue Gerald J. "Filterable Cell-associated cell wall-deficient Bacteria in renal diseases", Cell Wall-Deficient Bacteria, 1982, сс. 121-147).

Недостатком данного способа является его недостаточно высокая точность, обусловленная трудностью адаптации к искусственным питательным средам вариантов ДКС, индуцированных in vivo, а также относительная его длительность.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности способа дифференциальной диагностики бактериемии и сепсиса за счет обеспечения выявления в крови наряду с классическими формами бактерий их вариантов, дефектных по клеточной стенке, а также сокращение времени анализа.

Сущность способа заключается в следующем.

На исследование берут кровь больного в объеме 15-20 мл, добавляют, как правило, 0,1-0,2 мл гепарина (5000 ед/мл) и центрифугируют обычно в течение 10-15 мин при 800-1000 об/мин для удаления клеток крови. Затем плазму разливают по 2 мл в три стерильные пробирки (N 1-3) и центрифугируют обычно при 2-3 тыс. об/мин в течение 15-20 мин для осаждения микроорганизмов.

Для проведения микробиологического анализа готовят следующие пробы. Из пробирки N 1 удаляют 1 мл верхнего слоя нативной плазмы, в оставшемся 1 мл плазмы перемешивают образовавшийся после центрифугирования осадок (проба N 1). Эта проба предназначена для выявления возбудителя активно размножающегося в плазме. Из пробирки N 2 удаляют 1,5 мл верхнего слоя плазмы, в оставшихся 0,5 мл плазмы перемешивают ее осадок и добавляют 0,5 мл жидкой питательной среды (проба N 2).

Состав жидкой питательной среды определяется видом предполагаемого возбудителя.

Проба N 2 предназначена для выявления возбудителя, не способного к репродукции в нативной плазме из-за ее выраженной антимикробной активности.

Из пробирки N 3 плазму удаляют полностью, а к осадку добавляют 1 мл жидкой питательной среды (проба N 3). В этой пробе созданы наиболее благоприятные условия для роста классических бактериальных форм возбудителя.

Проба N 4, являющаяся контрольной, содержит 1 мл питательной среды.

Оптическую плотность в исследуемых пробах можно определять на стандартных приборах нефелометрах или автоматизированной микробиологической системе.

При работе на автоматизированной микробиологической системе кюветы с исследуемыми пробами инкубируют в термостатирующем устройстве (37^оС) и при постоянном перемешивании в течение 6-12 ч в пробах N 1-4 определяют оптическую плотность, показания которой воспроизводят графически на дисплее.

Нарастание оптической плотности в одной или нескольких пробах при отсутствии нарастания оптической плотности в контрольной пробе N 4 свидетельствует о наличии бактерий в крови больного.

При отсутствии нарастания оптической плотности через 6-12 ч исследования, пробы целесообразно встряхивать вручную и повторно определять в них оптическую плотность. Увеличение оптической плотности после встряхивания в пробах при отрицательном контроле также расценивается как положительный результат, свидетельствующий о придонном росте возбудителя.

Отсутствие через 12 ч исследования в пробах нарастания оптической плотности и отсутствие увеличения ее после дополнительного встряхивания проб расценивают как отрицательный результат.

Причем при выявлении роста возбудителя в пробе N 1, независимо от того, есть ли рост в других пробах, ставится предварительный диагноз сепсис, так как при сепсисе возбудитель не только присутствует в крови, но и активно размножается в ней. При выявлении роста возбудителя в пробах N 2 и/или N 3 и при отсутствии роста в пробе N 1 ставится диагноз - бактериемия, поскольку возбудитель присутствует в крови, но активно в ней не размножается.

Для определения морфологии возбудителя (классические формы бактерий и/или варианты ДКС) пробы, в которых наблюдается рост оптической плотности, микроскопируют.

Пробы, в которых рост оптической плотности не выявлен, не микроскопируют из-за возможного наличия в плазме артефактов, например, тромбоцитов, весьма сходных по морфологии с отдельными элементами L-форм бактерий.

Для получения культуры возбудителя целесообразно из проб N 1 и N 3 одновременно с исследованием оптической плотности делать посев на полутвердую питательную среду (0,8-1,3% ).

Ниже приведены примеры, подтверждающие сущность изобретения.

Исследования оптической плотности образцов крови во всех примерах проводили на автоматизированной микробиологической системе "Авантаж" фирмы Abbott (США).

От больных на исследование брали кровь в объеме 15-20 мл. К крови добавляли 0,15 мл гепарина (5000 ед/мл) и центрифугировали в течение 10 мин при 800 об/мин для осаждения клеток крови. Затем плазму крови разливали по 2 мл в три стерильные пробирки, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин для осаждения бактерий и готовили пробы, как было описано выше.

П р и м е р 1. Больная Г. Клинический диагноз - хронический пиелонефрит, состояние после пластики мочевого пузыря, хрониосепсис (? ). Готовят три пробы:
проба N 1 - нативная плазма;
проба N 2 - плазма, разведенная 1: 1 бульоном Мюллер-Хинтона;
контроль - бульон Мюллер-Хинтона.

Нарастание оптической плотности в нативной плазме и разведенной плазме при отрицательном контроле свидетельствует о наличии возбудителя в крови больной Г.

Нарастание оптической плотности в нативной плазме указывает на септическое состояние (подтверждает клинический диагноз).

При микроскопии пробы N 1 выявлены варианты бактерий ДКС-L-формы.

При микроскопии пробы N 2 выявлены классические формы бактерий.

При дальнейшем исследовании бактериальная культура была идентифицирована, как St. epidermidis.

П р и м е р 2. Больной К. Клинический диагноз - состояние после трансплантации почки, острая пневмония. Больного лечили цефалоспоринами, аминогликозидами. Кровь на исследование взята через 1 сутки после отмены антибактериальных препаратов.

Проба N 1 - нативная плазма.

Проба N 2 - плазма, разведенная 1: 1 бульоном Мюллер-Хинтона.

Контрольная проба - бульон Мюллер-Хинтона.

Нарастание оптической плотности в нативной плазме и разведенной плазме при отрицательном контроле свидетельствует о наличии бактерий в крови больного К.

Нарастание оптической плотности в нативной плазме указывает на септическое состояние.

При микроскопии пробы N 1 и пробы N 2 выявлены варианты бактерий ДКС-L-формы.

П р и м е р 3. Больная К. Клинический диагноз - корраловидный нефролитиз, состояние после нефроэктомии. Кровь на исследование взята на фоне антибактериальной терапии гентамицином.

Проба N 1 - нативная плазма.

Проба N 2 - плазма, разведенная 1: 1 бульоном Мюллер-Хинтона.

Проба N 3 - осадок плазмы крови, разведенный в 1 мл бульона Мюллер-Хинтона.

Контроль - бульон Мюллер-Хинтона.

Нарастание оптической плотности в пробе N 2 выявлено через 20 ч после дополнительного встряхивания вручную (увеличение продолжительности произошло по объективным причинам).

Нарастание оптической плотности в пробе N 2 при отрицательном контроле свидетельствует о придонном росте возбудителя.

Нарастание оптической плотности в разведенной плазме (проба N 2) при отсутствии нарастания плотности в нативной плазме (проба N 1) свидетельствует о наличии у больной К. бактериемии.

При микроскопии пробы N 2 выявлены бактерии ДКС-L-формы. Их наличие в крови подтверждено результатами параллельного посева нативной плазмы на полутвердый (0,8% ) агар Мюллер-Хинтона. На следующие сутки после посева на поверхности агара выявлен обильный рост микроколоний L-формы.

П р и м е р 4. Больная Л. Клинический диагноз - хронический пиелонефрит, состояние после пластики мочеточника, хрониосепсис (? ).

Проба N 1 - нативная плазма.

Проба N 2 - плазма, разведенная 1: 1 бульоном Мюллер-Хинтона.

Проба N 3 - осадок плазмы крови, разведенный в бульоне Мюллер-Хинтона.

Контроль - бульон Мюллер-Хинтона.

Нарастание оптической плотности выявлено в нативной плазме после дополнительного встряхивания вручную через 4,6 и 23 ч.

Нарастание оптической плотности в пробе N 1 при отрицательном контроле свидетельствует о придонном росте возбудителя.

Нарастание оптической плотности в нативной плазме крови при отсутствии нарастания в разведенной плазме свидетельствует о септическом состоянии.

При микроскопии пробы N 1 выявлены бактерии ДКС-L-формы. Их наличие в крови подтверждено результатами параллельного посева нативной плазмы на полутвердый (0,8% ) агар Мюллер-Хинтона.

На следующие сутки после посева на поверхности агара выявлен рост микроколоний L-форм, с оптически плотным центром и ажурной периферией.

П р и м е р 5. Больной Ш. Клинический диагноз - острый пиелонефрит. Состояние после аденомэктомии.

Проба N 1 - нативная плазма.

Проба N 2 - плазма, разведенная 1: 1 бульоном Мюллер-Хинтона.

Проба N 3 - осадок плазмы крови, разведенный бульоном Мюллер-Хинтона.

Контроль - бульон Мюллер-Хинтона.

Нарастания оптической плотности не выявлено ни в одной из исследуемых позиций. После дополнительного встряхивания вручную через 20 ч оптическая плотность не превышала исходную.

Результат исследования - отрицательный.

Таким образом, к преимуществам предлагаемого способа можно отнести следующее:
экспрессность (время анализа 6-12 ч);
высокая чувствительность, позволяющая одновременно выявлять как классические бактериальные формы, так и их варианты ДКС, особенно не способные к активной репродукции на питательных средах;
возможность осуществлять дифференциальную диагностику бактериемии и сепсиса;
с учетом ранней диагностики бактериемии и сепсиса осуществлять коррекцию проводимой антибактериальной терапии и оценку лечебного эффекта;
проводить оценку эффективности разрабатываемых антибактериальных препаратов in vivo в эксперименте на животных и при клинической апробации;
осуществлять бактериальный контроль крови на станциях переливания крови. (56) Методические рекомендации "Тактика микробиологического обследования больного с подозрением на сепсис". Министерство здравоохранения СССР, М. , 1989, с. 14.

Dominigue Gerald J. "Filterable Cell-associated cell wall-deficient Bacteria in renal diseases", Cell Wall-Deficient Bacteria, 1982, с. 121-147.

Использование: в медицине и ветеринарии и может применяться в дифференциальной микробиологической диагностике бактериемии и сепсиса. Сущность изобретения: отделяют элементы крови от плазмы, плазму центрифугируют, после чего готовят несколько проб, первая проба представляет собой нативную плазму крови, во второй пробе к плазме добавляют питательную среду, в третьей пробе к осадку после центрифугирования добавляют питательную среду, пробы инкубируют и затем определяют оптическую плотность. Нарастание оптической плотности в первой пробе свидетельствует о септическом состоянии больного, а нарастание оптической плотности в пробах два и/или три и при отсутствии роста оптической плотности в первой пробе свидетельствует о бактериемии. В случае отсутствия нарастания оптической плотности в исследуемых пробах их подвергают дополнительному встряхиванию, после чего повторно определяют оптическую плотность, причем нарастание оптической плотности после встряхивания свидетельствует о наличии возбудителя в крови. В предпочтительном варианте вторую пробу готовят разведением питательной средой в соотношении 1 : 1. Способ позволяет более точно осуществлять дифференциальную диагностику бактериемии и сепсиса, и сократить время анализа. 2 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИЕМИИ И СЕПСИСА, включающий отделение элементов крови от плазмы, инкубирование с питательной средой с последующей оценкой результатов, отличающийся тем, что плазму центрифугируют и перед инкубированием готовят три пробы, первая из которых содержит нативную плазму, вторая - нативную плазму и питательную среду и третья - осадок плазмы и питательную среду, а оценку результатов проводят по изменению оптической плотности в пробах и при ее нарастании в первой пробе диагностируют сепсис, а при нарастании во второй и/или третьей относительно контроля и отсутствии в первой - бактериемию. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вторую пробу готовят разведением плазмы питательной средой в соотношении 1 : 1. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при отсутствии нарастания оптической плотности в исследуемых пробах их подвергают встряхиванию с последующим определением оптической плотности.