ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12Q1/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для микробиологического анализа крови при сепсисе и бактериемии.

Бактериемия и сепсис продолжают оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильной высокой летальности даже в самых авторитетных отечественных и зарубежных клиниках.

Возбудителями сепсиса и бактериемии могут быть бактерии, грибы, простейшие и вирусы. Но на долю бактерий приходится более 95% случаев. Наибольший удельный вес среди возбудителей бактериемии и сепсиса составляют условно-патогенные микроорганизмы, при этом доля грамположительных и грамотрицательных бактерий приблизительно одинакова (1).

Регистрация бактериемии и сепсиса (выделение гемокультур) необходима для подтверждения диагноза и определения этиологии инфекционного процесса, обоснования выбора схемы антибиотикотерапии и оценки ее эффективности.

Известны питательные среды для микробиологического исследования крови (2, 3, 4, 5, 6).

К недостаткам указанных сред следует отнести слабую чувствительность, невысокий накопительный эффект, узкий перечень выделяемых микроорганизмов, а также необходимость многократного взятия проб крови для посева на плотные среды, что может привести к загрязнению самой культуры крови, искажающему результаты бактериологического анализа.

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является питательная среда для микробиологического исследования крови, состоящая из скошенного во флаконах питательного агара (твердая среда) и полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением глюкозы и агара (7).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, являются слабая чувствительность и длительность процесса выявления возбудителей при бактериемии. Это объясняется отсутствием в среде антикоагулянтов крови, что приводит к образованию сгустка фибрина, ограничивающего доступ питательных веществ к микробной клетке, а также отсутствие в среде веществ, нейтрализующих антимикробное действие лекарственных средств, которые могут накапливаться в крови при проведении антибактериальной терапии, что оказывает ингибирующее действие на рост микроорганизмов.

Кроме того, среда не содержит стимуляторов роста высокотребовательных микроорганизмов типа дрожжевых экстрактов и гидролизатов белка, а также буферную систему, необходимую для нейтрализации кислоты, которая образуется в результате сбраживания глюкозы.

Цель изобретения - повышение чувствительности и сокращение сроков выявления возбудителя.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что твердая среда дополнительно содержит панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и трис-(оксиметил)-аминометан, а полужидкая среда дополнительно содержит цитрат натрия или гепаринат натрия, пара-аминобензойную кислоту, панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт и трис-(оксиметил)-аминометан при следующем соотношении компонентов, в г/л дистиллированной воды:

Твердая среда

Питательный бульон10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина10,0-20,0Дрожжевой экстракт2,0-4,0Глюкоза8,0-12,0Трис-(оксиметил)-аминометан0,5-1,5Агар20,0-30,0

Полужидкая среда

Питательный бульон10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина10,0-20,0Дрожжевой экстракт2,0-4,0Глюкоза8,0-12,0Натрия цитрат0,3-0,5

или

Натрия гепаринат0,03-0,05Пара-аминобензойная кислота0,005-0,015Трис-(оксиметил)-аминометан0,5-1,5Агар0,4-0,8

Введение в среду дополнительно цитрата натрия или гепарината натрия, обладающих антикоагулянтными свойствами, препятствует образованию сгустка фибрина, что облегчает доступ питательных веществ и микробной клетки, тем самым способствуя активному размножению микроорганизмов в среде. Внесение в среду дополнительно пара-аминобензойной кислоты способствует нейтрализации антимикробного действия лекарственных средств, которые могут содержаться в крови, что также способствует активному размножению микроорганизмов в среде.

Использование в среде в качестве буфера трис-(оксиметил)-аминометана, обладающего большой буферной емкостью, способствует нейтрализации кислоты, образующейся в результате сбраживания микроорганизмами глюкозы, в результате чего не происходит сдвига рН в кислую сторону, препятствующую росту микроорганизмов.

Высокая питательная ценность предлагаемой среды за счет введения в среду дополнительно экстракта дрожжей и панкреатического гидролизата казеина обеспечивает питательные потребности микроорганизмов различных таксономических групп, в том числе высокотребовательных к составу питательных сред микроорганизмов, таких как стрептококки, стафилококки, менингококки, буцеллы.

Среду получают следующим образом.

Приготовление твердой среды

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 10 г питательного бульона, 10 г панкреатического гидролизата казеина, 2 г дрожжевого экстракта, 8 г глюкозы, 0,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 20 г агара. Смесь нагревают до полного расплавления агара, кипятят 1-2 мин, разливают во флаконы емкостью 250 мл и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

После стерилизации среду скашивают так, чтобы расплавленная среда образовала твердый слой на боковой стенке флакона.

Приготовление полужидкой среды

В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 10 г питательного бульона, 10 г панкреатического гидролизата казеина, 2 г дрожжевого экстракта, 8 г глюкозы, 0,3 г цитрата натрия или 0,03 г гепарината натрия, 0,005 г пара-аминобензойной кислоты, 0,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,4 г агара. Смесь нагревают до полного расплавления агара, кипятят 1-2 мин и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин.

Во флакон, содержащий твердую среду, с соблюдением правил асептики, добавляют 50 мл полужидкой среды, охлажденной до комнатной температуры.

Контроль качества среды осуществляют путем посева во флаконы тест-штаммов микроорганизмов, наиболее часто выделяемых при сепсисе и бактериемии: стафилококков, стрептококков, эшерихий, сальмонелл, клебсиелл, синегнойной палочки, бруцелл, листерий и др. из разведений 10^-6 и 10^-7 (соответственно 100 и 10 клеток). Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 24-78 ч.

Через каждые 6 ч инкубации флаконы наклоняют так, чтобы полужидкая среда смочила всю поверхность твердой среды, а затем вновь ставят в вертикальное положение.

После инкубации посевов в термостате при 37°С в течение 18-48 ч отмечают рост как визуально по развитию колоний на поверхности твердой среды, так и посредством высева из полужидкой среды, на питательный, кровяной и сывороточный агары.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что для приготовления твердой среды в 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 15 г питательного бульона, 15 г панкреатического гидролизата казеина, 3 г экстракта дрожжей, 10 г глюкозы, 1 г трис-(оксиметил)-аминометана, 25 г агара, а для приготовления полужидкой среды в 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 10 л питательного бульона, 10 г панкреатического гидролизата казеина, 3 г экстракта дрожжей, 10 г глюкозы, 0,4 г цитрата натрия или 0,04 г гепарината натрия, 0,01 г пара-аминобензойной кислоты, 1 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,6 г агара. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1, 2 тем, что для приготовления твердой среды в 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 20 г питательного бульона, 20 г панкреатического гидролизата казеина, 4 г дрожжевого экстракта, 12 г глюкозы, 1,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 30 г агара, а для приготовления полужидкой среды в 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 20 г питательного бульона, 20 г панкреатического гидролизата казеина, 4 г экстракта дрожжей, 12 г глюкозы, 0,5 г цитрата натрия или 0,05 г гепарината натрия, 0,015 г пара-аминобензойной кислоты, 1,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,8 г агара. Далее согласно примера 1.

В таблице представлены результаты бактериалогического контроля предлагаемой и известной среды. Из таблицы видно, что предлагаемая среда обладает высокой чувствительностью по отношению к штаммам, вызывающим бактериемию и сепсис, и превосходит по этому показателю известную среду, что позволяет выявить микроорганизмы при минимальном исходном содержании их в крови.

Кроме того, преимуществом среды является также то, что уже через 18-24 ч на поверхности твердой среды обнаруживался рост отдельных колоний микроорганизмов, а на контрольной только через 48-72 ч. Ранние сроки выявления возбудителя позволяют ускорить проведение терапевтических и противоэпидемиологических мероприятий.

При использовании предлагаемой среды нет необходимости многократно открывать флаконы с посевом для того, чтобы производить высев пробы на плотные питательные среды. Это уменьшает возможность загрязнения самой культуры крови, а также снижает возможность заражения высоковирулентными бактериями. Кроме того, микроорганизмы, плохо растущие в полужидкой среде, могут лучше расти на поверхности твердой среды. Рост бактерий в присутствии окрашивающих и придающих мутность веществ (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, сыворотка, гемоглобин), который трудно наблюдать в полужидкой среде, легко обнаружить по развитию колоний на поверхности твердой среды.

Указанные преимущества предлагаемой среды повышают эффективность диагностики при исследовании крови на гемокультуру.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

1. В.А.Руднов. Современные принципы антибактериальной терапии сепсиса. Антибиотики и химиотерапия, т.45, 7, 2000, с.3-5.

2. З.З.Султанов, Э.Д.Степанова, Е.А.Какулина. Питательная среда для выделения гемокультур при диагностике брюшного тифа и паратифов. Патент №2175671. Зарегист. 10 ноября 2001 г.

3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под. ред. М.О.Биргера. М., 1982 г., с.73, 255.

4. Р.К.Черкес, Л.Б.Богоявленская, Н.А.Бельская. Микробиология. М., 1986, с.240-241, 249, 261.

5. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам и микротестсистемам. М., Медицина, 2003, с.66-67.

6. В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.И.Болехан. Совершенствование методов микробиологического исследования крови у больных с гнойно-септическими инфекциями. Клин. лаб. диагн., 1998, №7, с 17-19.

7. Министерство Здравоохранения СССР. Приказ №535 22 апреля 1985 года. Приложение 1 к приказу Министерства Здравоохранения СССР №535 от 22 апреля 1985 г. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях. С-7 (прототип).

Таблица
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов микроорганизмов на предлагаемой и известной средахНаименование тест-штаммовНа предлагаемой средеНа известной средеПосевная дозаПосевная доза100 клеток10 клеток100 клеток10 клетокS.pyogenes Dick 1+++--S.pyogenes 1512+++--S.pneumoniae ЛД+++--S.epidermidis ATCC 14990++++++-N.meningitidis 637++---S.aureus 209 "P"++++++-P.aerogenes 27/99++++++++S.marcescens 1++++++++++E.coli 055++++++++++K.pneumoniae 51++++++++S.typhi H901++++++++B.abortus 19BA+++--L.monocytogenes 56++++++-Обозначения: +++ - интенсивный рост
++ - средний рост
+ - слабый рост
- отсутствие роста

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для микробиологического анализа крови при сепсисе и бактериемии. Питательная среда состоит из двух сред твердой и полужидкой. Твердая среда содержит агар, питательный бульон, панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу, трис (оксиметил) аминометан. Полужидкая - питательный бульон, панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу, натрия цитрат или натрия гепаринат, парааминобензойную кислоту, трис (оксиметил) аминометан, агар. Изобретение позволяет повысить чувствительность питательной среды и сократить сроки выявления возбудителя сепсиса и бактериемии. 1 табл.

Питательная среда для микробиологического исследования крови, состоящая из 2-х сред, содержащая в твердой среде агар, глюкозу, питательный бульон, а в полужидкой - агар, питательный бульон, отличающаяся тем, что твердая среда дополнительно содержит панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, трис(оксиметил)аминометан и дистиллированную воду, а полужидкая среда - панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу, натрия цитрат или натрия гепаринат, парааминобензойную кислоту, трис(оксиметил)аминометан и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

твердая среда:

Питательный бульон10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина10,0-20,0Дрожжевой экстракт2,0-4,0Глюкоза8,0-12,0Трис (оксиметил) аминометан0,5-1,5Агар20,0-30,0

полужидкая среда:

Питательный бульон10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина10,0-20,0Дрожжевой экстракт2,0-4,0Глюкоза8,0-12,0Натрия цитрат0,3-0,5Или натрия гепаринат0,03-0,05Парааминобензойная кислота0,005-0,015Трис (оксиметил) аминометан0,5-1,5Агар0,4-0,8