ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЕМОКУЛЬТУР Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для выделения гемокультур при сепсисе и бактериемии.

Бактериемия и сепсис продолжают оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильной высокой летальности даже в самых авторитетных отечественных и зарубежных клиниках.

Возбудителями сепсиса и бактериемии могут быть бактерии, грибы, простейшие и вирусы. Но на долю бактерий приходится более 95% случаев. Наибольший удельный вес среди возбудителей бактериемии и сепсиса составляют условно-патогенные микроорганизмы, при этом доля грамположительных и грамотрицательных бактерий приблизительно одинакова (1).

Регистрация бактериемии и сепсиса (выделение гемокультур) необходима для подтверждения диагноза и определения этиологии инфекционного процесса, обоснования выбора схемы антибиотикотерапии и оценки ее эффективности.

Известна питательная среда для выделения гемокультуры. Однако данная среда предназначена для выделения из крови только сальмонелл, что ограничивает ее использование (2).

Известна также питательная среда для выделения гемокультур (3, 4), содержащая источник азотистого питания в виде перевара Хоттингера или бульона Мартена и глюкозу (сахарный бульон). К недостаткам данной среды следует отнести образование сгустка фибрина при посеве крови и невысокий накопительный эффект ввиду отсутствия в составе среды стимуляторов роста высокотребовательных микроорганизмов.

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является питательная среда для выделения гемокультур и культивирования стрептококков, содержащая источники азотистого питания в виде ферментативного гидролизата крови и кислотного гидролизата казеина, стимулятор роста - экстракт кормовых дрожжей, органические и неорганические соли (5).

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является узкий перечень выделяемых микроорганизмов (преимущественно стрептококков), отсутствие в среде антикоагулянтов крови и веществ, нейтрализующих антимикробное действие лекарственных средств, которые могут накапливаться в крови при проведении антибактериальной терапии.

Отсутствие в составе среды антикоагулянтов приводит к образованию сгустка фибрина при посеве крови, ограничивающего доступ питательных веществ к микробной клетке, что тормозит размножение микроорганизмов. Отсутствие в среде веществ, нейтрализующих антимикробное действие лекарственных средств, сказывается отрицательно на высеваемости гемокультур.

Следствием указанных недостатков является слабая чувствительность и низкий накопительный эффект среды, а узкий перечень выделяемых микроорганизмов ограничивает использование известной среды в бактериологической практике.

Цель изобретения - повышение чувствительности, накопительного эффекта среды и расширение спектра выделяемых микроорганизмов.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда дополнительно содержит пара-аминобензойную кислоту и агар, в качестве органической соли содержит натрия цитрат или натрия гепаринат, в качестве буфера - трис-(оксиметил)-аминометан, а в качестве источников азотистого питания - питательный бульон рыбный и панкреатический гидролизат казеина при следующем соотношении компонентов, в г/л дистиллированной воды:

Питательный бульон рыбный 10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина 10,0-20,0Экстракт кормовых дрожжей 2,0-4,0Глюкоза 8,0-12,0Натрия цитрат или 0,3-0,5Натрия гепаринат 0,02-0,04Пара-аминобензойная кислота 0,005-0,015Трис-(оксиметил)-аминометан 0,5-1,5Агар 0,5-1,0

Введение в среду дополнительно пара-аминобензойной кислоты способствует нейтрализации антимикробного действия лекарственных средств, которые могут содержаться в крови при проведении антибактериальной терапии.

Внесение в предлагаемую среду дополнительно агара, обладающего высокой сорбционной способностью, способствует нейтрализации продуктов метаболизма и предохраняет микробные клетки от их токсического действия.

Введение в среду натрия цитрата или натрия гепарината, обладающих антикоагулянтными свойствами, вместо натрия ацетата, не обладающего таковыми, препятствует свертыванию крови (образованию сгустка фибрина), что облегчает доступ питательных веществ к микробной клетке, тем самым способствуя активному размножению микроорганизмов в среде.

Учитывая, что у больных с положительной гемокультурой концентрация возбудителей в крови обычно не превышает 10²/мл, обеспечение условий для проникновения питательных веществ среды к микробной клетке необходимо для активного накопления микроорганизмов в среде.

Использование в среде в качестве буфера трис-(оксиметил)-аминометана, обладающего большей буферной емкостью по сравнению с фосфатом натрия, способствует тому, что кислота, образующаяся в результате сбраживания микроорганизмами глюкозы, полностью нейтрализуется, в результате чего не происходит сдвига рН среды в кислую сторону, препятствующую росту микроорганизмов.

Высокая питательная ценность азотистых компонентов предлагаемой среды - питательного бульона из рыбы и панкреатического гидролизата казеина полностью обеспечивает питательные потребности микроорганизмов различных таксономических групп, вызывающих бактериемию.

В целом вся совокупность представленных признаков способствует расширению спектра выделяемых микроорганизмов повышает чувствительность среды и обеспечивает высокий накопительный эффект, что позволяет выделить гемокультуры при минимальном исходном количестве их в крови.

Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 10 г питательного бульона рыбного, 10 г панкреатического гидролизата казеина, 2 г дрожжевого экстрата, 8 г глюкозы, 0,3 г натрия цитрата или 0,02 г натрия гепарината, 0,005 г пара-аминобензойной кислоты, 0,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,5 г агара. Смесь нагревают до полного расправления агара, кипятят в течение 1-2 мин, разливают во флаконы по 100,0 мл и стерилизуют при 120°С в течение 30 мин. Контроль качества среды осуществляют путем посева во флаконы тест-штаммов микроорганизмов - наиболее часто выделяемых при сепсисе и бактериемии: стафилококков, стрептококков, сальмонел, эшерихий, менингококков, клебсиелл, бруцелл, иерсиний, синегнойной палочки, листерий и др. из разведения 10^-6 и 10^-7 (соответственно 10-10 клеток) (6).

После инкубации посевов в термостате при 37°С в течение 18-24 ч отмечают рост как визуально, так и посредством высева ихз флаконов петлей на питательный, кровяной и сывороточный агары. Накопительный эффект определяют по формуле где

п₁ - число колоний на чашках, засеянных из среды после 18-20 ч инкубации;

п₀ - число жизнеспособных клеток в посевной дозе;

к - степень разведения.

Пример 2. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 15 г питательного бульона рыбного, 15 г панкреатического гидролизата казеина, 3 г экстракта кормовых дрожжей, 10 г глюкозы, 0,4 г натрия цитрата или 0,04 натрия гепарината, 0,01 г пара-аминобензойной кислоты, 1,0 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,75 агара. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 20 г питательного бульона рыбного, 20 г панкреатического гидролизата казеина, 4 г экстракта кормовых дрожжей, 12 г глюкозы, 0,5 г натрия цитрата или 0,04 г натрия гепарината, 0,015 г пара-аминобензойной кислоты, 1,5 г трис-(оксиметил)-аминометана, 1,0 г агара. Далее согласно примеру 1.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в табл.1, 2.

Из таблицы 1, 2 видно, что предлагаемая среда обладает высокой чувствительностью и значительным накопительным эффектом по отношению к штаммам микроорганизмов наиболее часто, вызывающих бактериемию и сепсис, и превосходит по этим показателям известную среду, что позволяет выявить микроорганизмы при минимальном исходном содержании их в крови.

Источники информации

1. Современные принципы антибактериальной терапии сепсиса. В.А.Руднов. Антибиотики и химиотерапия, т.45, 7, 2000, с.3-5.

2. З.З.Султанов, Э.Д.Степанова, Е.А.Какулина. Питательная среда для выделения гемокультур при диагностике брюшного тифа и паратифов. Патент №2175671. Зарегист. 10 ноября 2001 г.

3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под. ред. М.О.Биргера. М., 1982 г, с.73, 255.

4. Р.К.Черкес, Л.Б.Богоявленская, Н.А.Бельская. Микробиология. М., 1986, с.240-241, 249, 261.

5. Справочник по микробиологическим питательным средам и микротестсистемам. Под. ред. М.М.Меджидова. Махачкала, 1999 г, с.41 (прототип).

6. В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева, В.П.Болехан. Совершенствование методов микробиологического исследования крови у больных с гнойно-септическими инфекциями. Клин. лаб. диагн., 1998, №7, с.17-19.

Табл.1.
Сравнительная характеристика роста тест-штаммов микроорганизмов на предлагаемой и известной средахНаименование тест-штаммовНа предлагаемой средеНа известной среде Посевная дозаПосевная доза 100 клеток10 клеток100 клеток10 клетокS.pyogenes Dick 1++++-S.pyogenes 1512++++-S.epidermidis ATCC 14990+++++++-S.aureus 46++++++++S.aureus 209 "Р".++++++++P.aerogenes 27/99++++++++++S.marcescens 1++++++++++E.coli 055++++++++++P.mirabilis 71(2)++++++++++P.vulgaris H19++++++++++K.pneumoniae 51++++++++++S.typhi H 901++++++++++S.pneumoniae ЛД++++-B.abortus 19BA++++-L.monocytogenes 56++++++++J.enterocolitica 335++++++++++J.pseudotuberculosis 111++++++++++N.meningitidis 637++---Обозначения: +++ - интенсивный рост++ - средний рост+ - слабый рост- отсутствие роста

Табл.2.
Сравнительная характеристика накопительного эффекта предлагаемой и известной средНаименование штаммовНакопительный эффект На предлагаемой средеНа известной средеS.pyogenes Dick 1740±15360±12S.pyogenes 1512750±20250±9S.epidermidis ATCC 14990845±18470±15S.aureus 46780±16540±12S.aureus 209 "P"874±20560±18P.aerogenes 27/991284±24900±22S.marcescens 1933±22850±16E.coli 0553346±501900±22P.mirabilis 71(2)3076±451500±21P.vulgaris H·192448±351400±26K.pneumoniae 511000±25860±12S.typhi H 9013140±421800±26S.pneumoniae ЛД766±10420±16B.abortus 19BA950±21130±14L.monocytogenes 561330±32900±24J.enterocolitica 335866±26420±11J.pseudotuberculosis 111960±30560±13N.meningitidis 637540±12-

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для выделения гемокультур при сепсисе и бактериемии. Среда содержит пара-аминобензойную кислоту и агар, в качестве органической соли содержит цитрат или гепаринат натрия, в качестве буфера - трис-(оксиметил)-аминометан, а в качестве источников азотистого питания - питательный бульон из рыбы и панкреатический гидролизат казеина, экстракт кормовых дрожжей и глюкозу. Предлагаемая среда по чувствительности и накопительному эффекту по отношению к штаммам микроорганизмов, наиболее часто вызывающих бактериемию и сепсис, превосходит известную среду, что позволяет выявить микроорганизмы при минимальном исходном содержании их в крови. Указанные преимущества предлагаемой среды повышают эффективность диагностики при исследовании крови на гемокультуру. 2 табл.

Питательная среда для выделения гемокультур, содержащая источники азотистого питания, экстракт кормовых дрожжей, глюкозу, буфер, органическую соль, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит парааминобензойную кислоту и агар, в качестве органической соли содержит натрия цитрат или натрия гепаринат, в качестве буфера - трис-(оксиметил)-аминометан, в качестве источников азотистого питания - питательный бульон рыбный и панкреатический гидролизат казеина при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

Питательный бульон рыбный10,0-20,0Панкреатический гидролизат казеина10,0-20,0Экстракт кормовых дрожжей2,0-4,0Глюкоза8,0-12,0Натрия цитрат0,3-0,5или Натрия гепаринат0,03-0,05Парааминобензойная кислота0,005-0,015Трис-(оксиметил)-аминометан0,5-1,5Агар0,5-1,0