ШТАММ МИКРОМИЦЕТА TRICHODERMA VIRIDE PERS. EX S.F. GRAY ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СЕРОЙ ГНИЛИ ВИНОГРАДА Российский патент 1994 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и представляет собой новый штамм, который может быть использован при хранении винограда в качестве источника биологической защиты.

Для биологической защиты успешнее всего применяются представители рода Trichoderma. Эффективность использования грибов данного рода подтверждена многолетней практикой в борьбе с почвенными грибами (см. С. Dennis and J. Webster, 1971, TransBr. mycol. Soc. 57 (3), 363-369; Еlad et al. 1982, Can. J. Microbiology, 28, 719-725; Elad J. , Barek R. , Chet I. , 1984, Soil Biol. and Biochem. , 16, 4, 381-386; M. N. Schroth and J. G. Hancock, 1981, Ann. Rev. Microbiology, 35, 459-463).

В качестве грибов-антагонистов чаще других используются виды Тrichoderma harzianum и виды Т. viride. Естественное местообитание этих грибов - почва, где они чаще всего встречаются в подстилке. Это активные целлюлозоразрушители, участвующие в процессах деструкции растительного опада.

Известна антагонистическая активность видов Тrichoderma против несовершенных грибов рода Aspergillus - A. cangidus, A. luchuensis, A. niger, A. fumigatus, A. terreus, (Rai B. , Singh V. N. , Singh D. - Plant and Soil, 1980, 57, N 1, p. 131-135); рода Fusarium: F. oxysporum, F. solani, F. graminearum, F. culmorum, Alternaria spp. , Botrytis cinerea, Collectotrichum Lindemuthianum Rhizoct; аскомицетов ( Сhaetomium spp. , Coniochaeta) базидиальных (Lentinus edodes (Бадяй С. Б. Защита растений, вып. 9, - С. 75. . . 78; Beratlief Z. , Morched S. - Bull. Acad. Sci. agr. et forest. , 1983, N 12; Champion L. , J. E. Mitchel Sci. , Soc. , 1978, 94, N 2, p. 70; Knetmal M. В. , Hasabnis S. N. , Sardeshpande T. S. , Diwakar M. P. - Curr. Sci. (India), 1984, 53, N 16, p, 862-868; Lacicova B. , Pieta D. - Ochr. rosl. , 1985, 29, N 5, p. 3-5; Tokimoto K. , Repts Tottori Mycol. Inst. , 1984, N 22, p. 63-64; Venkatacubbaian P. , Safuula K. M. - Pros. Indian Nat. Sci. Acad. , 1984, B 50, N 5, p. 525-529).

Известно практическое использование гиперпаразитов и антагонистов против широкого круга грибов - возбудителей вегетирующих растений, а также послеуборочных гнилей плодов, овощей и винограда при хранении.

В частности, к снижению количества серой гнили на ягодах земляники после уборки урожая привело применение Trichoderma viride в поле (Trondmo A. , Dennis C. - Neth. J. Plant Pathol. , 1977, v. 83, Suppl. 1, p. 449-455).

Использование суспензий конидий Trichoderma harzianum для обработки яблоневых деревьев в период цветения привело к уменьшению количества гнили, вызванной В. cinerea на яблоках (Тronsmo A. , Ystaas J. - Plant Dis. , 1980, v. 64, p. 1009).

Оценены антагонистические свойства 9 видов рода Тrichoderma в отношении В. cinerea. Обнаружена высокая антагонистическая активность у группы штаммов Тrichoderma, в которую входлили виды Т. viride, T. harzianum, T. koningii, T. longirachiatum (Sailloux, Froidefond - Bull. OEPP, 1987, v. 17, N 4, р. 541-547).

Известна защита винограда от серой гнили с помощью Trichoderma viride и Т. harzianum с целью улучшения качества урожая (Dubos B. , Ulit J. , Bugaret Y. , Verdu D. - L'academie d'agriculture de France, 1978, 64, N 14, р. 1159-1167; Dubos B. - Proc. Int. Cont. Integr. Plant Prot. , Budapest, 1983, p. 41-47; Dubos B. in. : Current perspectives in microbial ecology. Wachington, 1984, p. 370-373; Dubos B. , Bulit J. - Microbial ecology of the phylloplane. Longon est, 1981, p. 353-367; Davet P. - Bull. OEPP, 1987, 17, N 4, p. 535-540; Nair N. G. , Parker F. E. - Plant Pathol. , 1985, 34, N 2, p. 302-305).

Разработкa биологического метода борьбы с патогенами винограда в условиях хранения имеет ряд трудностей. Антагонисты должны быть способны развиваться при низких температурах в хранилищах, сохраняться определенное время на поверхности ягод (Сооk R. J. - Phytopathology, 1985, 75, N 1, p. 25-29; Wilson C. L. , Pusey P. L. - Plant Diseases, 1985, 69, N 5, р. 375-378).

Из известных штаммов грибов рода Тrichoderma, используемых как средство биологической борьбы против патогенных грибов, являются штаммы Trichoderma harzianum Rifai T-315 (АТСС N 20671) и Тrichoderma harzianum Rifai Т-35 (АТСС N 20681), описанные в европатенте N 01333878.

Данные штаммы используются против грибов из родов Рythium, Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium для борьбы с такими заболеваниями, как черная ножка, корневая гниль, пелликуляриоз и шейковая гниль рассадных культур.

Однако виды или штаммы Trichoderma могут быть по-разному антагонистичны к разным видам грибов (Н. D. Wells et al. 1972, Phytopathology, 62, р. 442-447).

В дополнение к таким различиям в антагонизме было обнаружно что внешние условия, в которых происходит взаимодействие, также влияют на степень биологической борьбы.

Заявляемый штамм Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 92 ВKM F-3273 D предлагается как средство биологической борьбы с патогенами винограда в условиях хранения, в частности к Вotrytis cinerea.

В качестве прототипа взят стандартный препарат Триходермин [2] . Его эффективность проявляется при использовании на ягодных культурах в период цветения при борьбе с серой гнилью.

Недостатком известного препарата является то, что он недостаточно эффективно воздействует на серую гниль винограда.

Целью изобретения является выделение штамма триходермы, обладающего повышенной антагонистической активностью по отношению к возбудителю серой гнили винограда Вotrytis cinerea и способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда, позволяющий уменьшить потери винограда от гниения путем уничтожения спор грибов на поверхности ягод перед их закладной на хранение и подавления спороношения в процессе хранения.

Штамм Тrichoderma virige Pers. ex S. F. Gray ВКМ F - 3273 D выделен из гниющей древесины, поврежденной жуками-точильщиками. Номер штамма 92. Зрелая культура на агаровых косяках хранится в холодильнике при температуре от -2 до +3^оС с периодическими пересевами 2-3 раза в течение года.

Полученный штамм обладает следующими свойствами.

Макроморфология. Колонии на среде Чапека при 22^оС достигают диаметра 5,5-6,0 см. Мицелий слабозаметный, тонкий, перемежающий темно-зелеными и белыми дерновинками. Спороношение темно-зеленое. Обратная сторона колоний бесцветная. На сусло-агаре наблюдается интенсивное развитие воздушного мицелия. Мицелий белый, образующий обильные густые дерновинки. Спороношение умеренное.

Микроморфология. Конидии полушаровидные, шиповатые 4,5-4,8х4,2-4,5 мкм.

Активность штамма. Штамм N 92 является активным антагонистом по отношению к возбудителю серой гнили винограда Воtrytis cinerea. Обладает способностью сдерживать развитие патогена в период вегетации и хранения винограда. Проявляет активность при 2^оС.

Способ определения активности штамма.

Лабораторные испытания проведены с использованием метода агаровых блоков (СЭГИ, 1983) при температурах 2^оС и 22-25^оС. Метод основан на способности растворимых метаболитов диффундировать в агаровую пластинку и в зависимости от интенсивности воздействия образовывать более или менее широкие зоны угнетения или стимулирования роста патогена (табл. 1).

В лабораторных условиях культуру Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 92 BKM F - 3273 D выращивают на косяках сусло-агара и среде Чапека в течение 12-14 сут при 22-25^оС, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала.

Пример получения препарата с помощью штамма гриба Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray BKM F - 3273 D.

Для приготовления водной суспензии препарата в пробирку с маточной культурой штамма N 92 наливают 10 мл стерильной дистиллированной воды, затем микробиологической иглой осуществляют смыв спороносящего слоя с поверхности питательной среды; пробирку тщательно встряхивают. Предварительно подготавливают пластиковые кюветы размером 0,31х0,25 м, залитые стерильной питательной средой - сусло-агар (из расчета 0,5 л среды на одну кювету) и накрывают их плотно прилегающим простерилизованным стеклом. Водную суспензию маточной культуры вносят в кюветы (из расчета 20 мл суспензии на кювету) и стерильным стеклянным шпателем растирают по всей поверхности питательной среды.

Культуру штамма N 92 выращивают при комнатной температуре в течение 12-14 суток. По истечении этого срока проводят смыв; кюветы освобождают от стекол и заливают небольшим количеством стерильной дистиллированной воды; затем стерильным шпателем тщательно смывают выросшую культуру с поверхности питательной среды. Водную суспензию гриба фильтруют через двойной слой стерильной марли. В полученном маточном растворе препарата определяют титр спор. Подсчет проводят в камере Горяева. Готовый продукт представляет собой жидкость темно-зеленого цвета.

Полевые испытания проводили в Молдове на винограде сортов Молдова, Мускат гамбургский и Италия.

Пример конкретного выполнения. Столовые сорта винограда (Молдова, Мускат гамбургский, Италия) в период цветения и за 3-10 сут до уборки опрыскивают водной суспензией штамма гриба Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 92 BKM F - 3273 D в концентрации 108 спор/мл, при расходе раствора 100 л/га.

Результаты испытания приведены в табл. 2 и 3.

Данные табл. 2 и 3 свидетельствуют о том, что обработка винограда водной суспензией штамма Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray 92 BKM F - 3273 D позволяет снизить потери от гниения во время хранения на 8-10% и повысить выход пригодного для хранения винограда на 8-10% в зависимости от сорта. Использование штамма микромицета (N 92) Тrichoderma viride Pers. ex S. F. Gray BMK F - 3273 D в качестве биологического препарата для борьбы с Воtrytis cinerea снижает количество химических обработок винограда, а также уменьшает их вредное побочное действие. Достоинство применения данного штамма в том, что он оказывает также ингибирующее воздействие на вид Рenicillium verrucosum var. cyclopium и не образуется устойчивых штаммов Воtrytis, как это происходит при применении фунгицидов.

Использование: сельское хозяйство, производство биологического средства защиты растений и касается нового штамма микромицета для получения этого средства. Сущность изобретения: штамм микромицета Trichoderma viride Pers. ex. S. F. Gray 92 выделен из гниющей древесины, поврежденной жуками-точильщиками. Депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под N F 3273Д. Штамм выращивают на сусло-агаре при комнатной температуре в течение 12 - 14 сут. Затем смывают выросшую культуру с поверхности среды, полученную суспензию фильтруют и получают жидкость темно-зеленого цвета. Для обработки винограда используют вышеполученную жидкость с титром 10⁸спор/мл при расходе 1000 л/га. 3 табл.

Штамм микромицета Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray ВКМ F-3273Д для получения препарата против возбудителя серой гнили винограда.