ШТАММ ГРИБА TRICHODERMA LIGNORUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ Российский патент 1998 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/885 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, фитопатологии и может быть использовано для получения препарата против фитопатогенных грибов и бактерий.

Известен штамм Trichoderma longibrachiatum 7-26, обладающий целлюлозной активностью [1] . Для штамма оптимизировано твердофазное и глубинное культивирование. Штамм не требователен к питательной среде и в качестве источника углерода способен использовать отходы различных отраслей промышленности. Недостатком данного штамма является то, что штамм не проявляет антагонистическую активность к бактериальным фитопатогенам.

Известен штамм Trichoderma lignorum T13-82. Штамм растет при 26^oC на традиционных средах с использованием зерна [2]. Штамм проявляет антагонистическую активность к фитопатогенным грибам родов Alternaria и Fusarium и в меньшей степени - к бактериальным штаммам. Используется для получения препарата триходермина. Основными недостатками данного штамма являются: штамм культивируют с использованием только твердофазного метода; штамм не обладает активностью против Pseudomonas corrugata. Снижение фитопатогенного потенциала почвы после обработки штаммом не описано.

Наиболее близким к заявленному штамму является штамм Trichoderma lignorum [3, прототип]. Для культивирования этого штамма требуются традиционные среды. Штамм эффективен в борьбе с почвенными фитопатогенами, вызывающими корневые гнили злаков, вилт хлопчатника, ризоктониоз картофеля, черную ножку капусты, и рядом других заболеваний. Особенно перспективен штамм при использовании в защищенном грунте. Штамм хранится в Белорусском НИЗРе. Основными недостатками штамма являются: необходимость постоянного поддержания штамма путем пересевов на свежий сусло-агар; постоянная селекция на антагонистические свойства; длительное, двухстадийное выращивание. Фитопатогенный потенциал почвы при двукратной обработке снижается в 4 раза.

Технической задачей изобретения является получение штамма, обеспечивающего при обработке большую степень снижения фитопатогенного потенциала почвы, стабильного по своим антагонистическим характеристикам, способного долго сохранять свои свойства при длительном хранении.

Поставленная задача решается путем выявления и использования штамма Trichoderma lignorum.

Штамм Trichoderma lignorum получен с помощью ступенчатого отбора по признакам антибиотической, ферментативной активности и продуктивности при выращивании на плотных и жидких питательных средах.

Ступенчатый отбор проводится с использованием метода моноконидиального рассева на чашки Петри со средой Чапека. Среди полученных культур отбирают морфологически выровненные и показавшие высокую антибиотическую и ферментативную активность изоляты для следующего моноконидиального рассева. Культуры, не сохранявшие требуемых свойств (имевшие сектора и пятна, отличные по цвету от исходной культуры, либо полностью изменившие пигментацию колонии, низкую антибиотическую и ферментативную активность) отбраковывают.

Штамм стабильно сохраняет морфологические свойства, антибиотическую и ферментативную активность в течение 10 пассажей.

Штамм Trichoderma lignorum характеризуется следующими признаками.

Морфолого-культуральные признаки: при выращивании штамма при 26^oC на среде CA (pH 6,0) колония распростертая темно-зеленого цвета. Дерновинки крупные, сначала белые, на 3 - 4 сутки зеленые, позднее темно-зеленые, бархатистые. Обратная сторона колонии имеет светло-зеленый цвет. Конидиеносцы в виде боковых ответвлений гиф воздушного мицелия (76,0 x 2,3 мкм), фиалиды бутылевидные, расположены мутовками по 2 - 3 или одиночно (6,2 x 1,5 мкм). Конидии верхушечные округлые (3 x 2,5 мкм), собраны в сферические головки.

Физиолого-биохимические признаки: штамм растет при температуре 4 - 30^oC, pH среды 5 - 7,2, оптимальная температура 24 - 26^oC, pH 6 - 6,5. Отношение к источнику углерода. Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, лактозу. Соли органических кислот (щавелевокислый натрий, лимоннокислый натрий) оказывают ингибирующее влияние на рост гриба в культуре. Хорошо усваивает пептон, аспарагин, удовлетворительно - азотнокислый натрий и калий. Крахмал и клетчатку гидролизует, желатину разжижает, молоко пептонизирует.

Штамм способен накапливать до 20 г/л сухого вещества на 4-е сутки глубинного культивирования.

Эффективность штамма иллюстрируют данные испытаний в закрытом грунте. Опытная партия (жидкая препаративная форма) испытывалась в производственных условиях на площади 480 м² против фузариоза (Fusarium sp.), серой гнили (Botrytis cinerea) и пустостебельности томатов (Pseudomonas corrugata). Результаты приведены в таблице.

Полученный штамм Trichoderma lignorum депонирован в НИИ коллекций культур клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор") под регистрационным номером F5.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:
- большая степень снижения фитопатогенного потенциала почвы,
- стабильность по своим антагонистическим характеристикам,
- способность долго сохранять свои штаммовые свойства при длительном хранении.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для получения препарата триходермина никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Получение препарата методом глубинного культивирования. Маточную культуру готовят на среде, содержащей 1 часть пивного сусла и 2 части воды (водопроводной), pH 6,5, в течение 48 ч, затем вносят в ферментер емкостью 20 литров в количестве 1 : 10 к объему питательной среды. Культивирование в ферментере проводят на среде, содержащей, г/л: пептон 3, сахароза 5, кукурузный экстракт 10, NaNO₃ 2, с объемом аэрации 1 : 3 при температуре 28^oC. Масса сухого вещества после 72 ч роста гриба составляет 20 г/л.

Полученный препарат представляет собой жидкость, содержащую в своем составе питательную среду, споры и мицелий гриба, экзотоксины. Титр препарата 10 млрд. кл/мл.

Пример 2. Получение препарата методом твердофазной ферментации на сыпучих питательных средах. В качестве носителя используют ячмень. Маточную культуру для засева зерна выращивают на качалке с круговым вращением 200 об/мин на сусле, разбавленном водопроводной водой в соотношении 1 : 2 при 28^oC. Препарат выращивают в течение 5 суток при 28^oC. Титр готового препарата 10 - 19 млрд. спор/г. Препарат используется в дозе 20 кг/1000 м², что позволяет снизить заболевания овощных культур закрытого грунта (огурцы, томаты) на 37,5 - 98% и получить прибавку урожая на 2,6 кг/м² (огурцы) и 1,2 кг/м² (томаты).

Пример 3. Обработка почвы для улучшения фитосанитарного состояния грунтов (закрытый грунт). После однократного внесения жидкого препарата в количестве 30 г/м² фитопатогенный потенциал в прикорневой зоне растений снижается с 9670 до 1730 колоний в 1 г почвы.

Источники информации
1. Гернет М.В. Биотехнология. 1985, N 3, с. 27 - 36.

2. Авторское свидетельство СССР N 1717052. Штамм гриба Trichoderma lignorum ВНИСХМ N 37 для производства триходермина. БИ 9, 1992.

3. Бадай С.В. Защита растений. 1986, N 5, с. 32.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, касается нового штамма гриба для получения средств защиты растений от фитопатогенов. Штамм получен путем ступенчатого отбора по признакам антибиотической, ферментативной активности и продуктивности. Штамм депонирован в НИИ коллекций культуры клеток Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером F5. Штамм обладает антагонистической активностью против грибов Fusarium, Botrytis cinerea и Pseudomonas corrugata. Применение штамма для обработки овощных культур - огурцов и томатов - позволяет снизить заболевание овощных культур на 37,5 - 98% и получить прибавку урожая соответственно на 2,6 кг и 1,2 кг с 1 м². 1 табл.

Штамм Trichoderma lignorum НИИ ККМ ГНЦ ВВ "Вектор" F5, используемый против фитопатогенных грибов и бактерий.