ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕНТАПЕПТИДОВ Российский патент 1994 года по МПК C07K7/06 A61K37/02 

Изобретение относится к производным пентапептида и особенно к пентапептидным соединениям, которые проявляют ингибирующее воздейстнвие на синтез ДНК и на митотическую скорость при регенерации печени, а также на ДНК-синтез и рост линии злокачественных клеток гепатомы in vitro и in vivo.

Таким образом, пентапептидные производные согласно изобретению могут быть полезны при лечении гепатических заболеваний у млекопитающих, в частности человека, у которых наблюдается рост нежелательных клеток, таких как, например, гепатический рак. Пептид также воздействует на нормальные клетки печени и, следовательно, может использоваться и в других ситуациях, при которых желательно управлять ростом клеток печени.

На сегодняшний день известны пентапептиды с ингибирующей рост активностью, которые описаны в заявке WO 87/00180 (PCT/-11086/00041). Описанные там пентапептиды ингибиркуют пролиферацию клеток в плоском эпителии и поэтому пригодны для лечения роста нежелательных клеток в эпидермисе. Однако эта активность селективна и ранее известные пентапептиды не одинаково активны в отношении ингибирования роста нежелательных клеток в других органах.

В статье Яна Эрика Паульсена, Карла-Л. Рейхельта и Анны К. Петерсен в Virchows Arch (1987) 54: 152-154, под названием "Porification and Characterization of a growth inhibitory hepatic peptide, a preliminary note" описывается, что пентапептид, выделенный из мышиной печени, ингибирует ДНК-синтез и митотическую скорость при регенерации мышиной печени. Обнаружено, что после резеции печени ДНК-синтез и митотическая скорость значительно снижаются после обработки пептидом, выделенным из мышиной печени, по сравнению с контрольными соединениями.

За исключением того, что, вероятно, речь идет о пентапептидах с N-концевым пироглутаматом, ничего не сказано в отношении того, какие аминокислоты включены в них и какова их последовательность. После обширного исследования авторы обнаружили несколько новыx пентапептидов с полностью идентифицированной структурой.

В соответствии с изобретением предлагаются новые пентапептиды общей формулы 1 где Х₁, Х₂ и Х₃ каждый независимо представляет ОН или NH₂, при условии, что Х₂ и Х₃ оба одновременно не могут быть NH₂.

Соединения могут быть получены любым способом, который пригоден для получения пептидов. На поздней стадии получения пептид обычно существует в виде защищенного производного, и последней стадией (или последними стадиями) способа является отщепление защитных групп (от амино, амидо, гидроксида и/или карбоксила). Особенно подходящим способом является так называемый твердофазный способ, который считается подходящим для получения олигопептидов и их аналогов быстрым образом и с хорошими выходами продукта. При таком способе растущую пептидную цепь сохраняют присоединенной к твердому полимерному носителю, и синтез начинают со связывания С-концевой аминокислоты с полимером. Наиболее обычные аминокислоты, присоединяемые к полимерному носителю, на сегодняшний день промышленно доступны. Следующую аминокислоту затем привязывают к данной полимер-связанной аминокислоте с помощью повторного цикла со снятием защиты, промывки и сочетания. С помощью данного способа весь пептид получается в полимер-связанной форме, и после окончания полного построения конечный продукт отщепляют от полимера при помощи подходящего реагента. Одновременно или после этого остальные защитные группы также удаляют.

При жидкофазном пептидном синтезе пептидная цепь начинается с С-концевой аминокислоты. Все боковые цепи, за исключением α-аминогруппы, обычно защищают подходящими защитными группами, устойчивыми в условиях, используемых в течение всего процесса синтеза. α-Аминогруппа либо свободна для взаимодействия, либо полузащищена легко удаляемой органической или неорганической солью.

К раствору данной С-концевой аминокислоты (или пептида) добавляют при перемешивании следующую аминокислоту, подлежащую сочетанию с растущей пептидной цепью. Все реакционно-способные боковые цепи указанной следующей аминокислоты, за исключением α-карбокси-группы, обычно защищают подходящими защитными группами, устойчивыми в условиях, используемых в течение всего процесса синтеза. α-карбоксильную группу либо предварительно активируют любым подходящим способом, либо она готова для активирования in situ любым пригодным способом для присоединения к свободной аминогруппе С-концевой аминокислоты (или пептида). Если С-концевая аминокислота (или пептид) полузащищена органической или неорганической солью, для создания свободной α-аминофункции добавляется один эквивалент подходящего основания.

Для активации in situ можно использовать любой подходящий метод активации, так как, например, с использованием ДЦК, ЭЭДХ, смешанный ангидрид, БОФ, азид и так далее.

Предварительно активированными реагентами могут быть симметричные ангидриды, реакционноспособные сложные эфиры и др.

И предварительной активации, и присоединениями с использованием активированной in situ карбоновой кислоты могут способствовать некоторые химические соединения, добавляемые для ускорения реакции или для подавления/предотвращения рацемизации. Такими добавками могут быть такие соединения, как гидроксибенззотриазол, N-гидротокси-сукинимид и так далее.

Полученный пептид выделяют из реакционной смеси с помощью любой подходящей процедуры, такой как жидкость-жидкостная экстракция или осаждение. Неочищенный продукт обычно используют без дальнейшей очистки, а испытания на чистоту/идентичность как правило осуществляют с использованием тонкослойной хроматографии (ТСХ). N-концевую α-аминогруппу нового пептида освобождают от защиты с помощью реагента, который способен селективно и количественно удалять временную N-защитную группу, оставляя незатронутыми другие (в боковой цепи) защитные группы.

Этот защищенный пептид со свободной α-аминогруппой теперь является С-концевой частью растущей пептидной цепи, и вся процедура повторяется с добавлением следующей аминокислоты, добавляемой к N-концу растущей пептидной цепи.

Данная процедура повторяется до тех пор, пока не будет получено защищенное производное всего пептида.

Свободный пептид затем получают путем обработки защищенного производного пептида реагентами, способными отщеплять все защитные группы. Примерами таких реакций-реагентов являются:
Трифторуксусная кислота для средне-кислото-стойких защитных групп;
Гидрогенолиз над палладием на угле для бензильных защитных групп;
Жидкий фторводород для очень кислото-устойчивых защитных групп.

Таким образом, аминокислотными звеньями, которые могут быть частью пентапептида, считая от С-конца, являются следующие: 1) Аспарагиновая кислота (Asp) X₂ = X₃ = OH
β-Аспарагин (β-Asn) X₂ = NH₂, X₃ = OH
α-Acпарагин (α-Asn) Х₂ = ОН, Х₃ = NH₂
2) Серин (Ser)
3) Глицин (Gly)
4) Глютами- новая кислота (Glu) Х₁ = ОН
Глютамин (Gln) Х₁ = NH₂
5) Пироглютаминовая кислота (pGlu)
Как правило, все аминокислоты используют в их L-форме.

Два соединения формулы 1 подвергались дальнейшим испытаниям in vitro и in vivo. Этими соединения являются:
А: pGlu-Gln-Gly-Ser-β-Asn
(X₁ = NH₂, X₂ = NH₂, X₃ = OH)
B: pGlu-Glu-Gly-Ser-β-Asn
(X₁ = OH, X₂ = NH₂, X₃ = OH)
(все аминокислоты имеют L-конфигурацию).

Данные в табл. 1 показывают, как соединение А ингибирует регенеративное увеличение вес печени у мышей после 70% резекции печени. Соединение А инъекцировалось ежедневно внутрибрюшинно в 12.00 час дня в солевом физиологическом растворе. Контрольных животных обрабатывали только солевым раствором.

Т а б л и ц а 1
Было обнаружено также, что указанный пептид ингибирует также ДНК-синтез и пролиферацию МН₁С₁, клонального штамма из трансплантируемой гепатомы Морриса in vitro.

Соединение В вводили мышам, подвергнутым 70% резекции печени, и митотическую скорость измеряли через 5 ч после введения. Было обнаружено, что митотическая скорость составляет около 40% митотической скорости контрольных образцов, как явствует из следующей табл. 2.

Т а б л и ц а 2
Через 4 ч после обработки тем же пептидом В было обнаружено также, что митотическая скорость снижается приблизительно на 50% от скорости в контрольных образцах через 48 ч после интоксикации ССl₄. Данные приведены в табл. 3.

Т а б л и ц а 3
Пептид В понижает общее количество клеток гепатомы крыс in vitro приблизительно до 70% от контрольных значений через 72 ч после добавления пептида. Это видно из табл. 4.

Т а б л и ц а 4
Для испытания активности соединения В в отношении линии клеток злокачественной гепатомы in vivo использовали четыре группы, в каждой по 8 животных, и заданное количество опухолевых клеток вводили внутривенно, после чего животных подвергали лечению с использованием трех различных концентраций соединения В.

В данном эксперименте измерялось распространение метастазов в легких, и в обработанных группах можно было наблюдать большое снижение распространения метастаз.

Эксперимент.

Сразу же после инъекции пептида в 30-дневным самкам крыс Буффало инъецировали 10⁴ клеток гепатомы крыс (МН₁С₁) в хвостовую вену. Затем крысам внутрибрюшиннно вводили пептид три раза в неделю в течение эксперимента (всего 12 инъекций), Через четыре недели после начала эксперимента взвешивали (влажная масса) легкие, содержащие метастазы в результате введения клеток гепатомы.

Результаты.

Пептид В снижает массу легкого (легкое + метастазы) приблизительно до 40% от контрольных значений. Снижение опухолевой массы даже значительно выше, когда вычитали массу нормального легкого. Испытания иллюстрируются данными в табл. 5.

Т а б л и ц а 5
Когда массу нормальной легочной ткани принимают во внимание и вычитают из найденной массы, определяют массу опухоли. См. табл. 6, в которой масса вычисленa как % от контроля.

Т а б л и ц а 6
Ввиду описанных свойств новые пентапептиды формулы 1 особенно пригодны при лечении гепатического рака и могут вводиться в виде обычных препаративных форм, применяемых для перентерального введения. Подходящие дозы зависят от фактического пептида, пациента и способа введения и формы композиции. Однако дозы, используемые в вышеприведенных примерах, указывают релевантные дозы.

Получение пептидов формулы 1 дополнительно иллюстрируется ниже:
Пептиды получали с использованием твердофазного метода Меррифилда. В реакционный сосуд помещали известное количество носителя на основе смолы и смешивали с 150 мл следующих растворителей в указанном порядке. Все операции промывки занимали одну минуту, если не указано что-либо иное. Все используемые аминокислоты имели 1-конфигурацию. Asn был β-Asn.

Метиленхлорид - три раза
40% трифторуксусная кислота в метиленхлориде
40% трифторуксусная кислота в метиленхлориде - 30 мин - один раз
Метиленхлорид - один раз
Этанол - один раз
Метиленхлорид - дважды
10% триэтиламин в метиленхлориде - один раз
10% триэтиламин в метиленхлориде - 10 мин - один раз
Метиленхлорид - три раза
Связывание с аминокислотой
Каждую аминокислоту соединяют по очереди, начиная с карбоксилконцевой аминокислоты. Равные эквиваленты аминокислоты Вос и ДЦК добавляли в избытке в пересчете на используемую смолу. После каждого присоединения смолу проверяли с помощью Кайзертеста, чтобы удостовериться в том, что реакция завершена. Снятие защиты осуществлялось с использованием 40% трифторуксусной кислоты, и данную методику также контролировали Кайзертестом. Синтез считался полным, когда успешно присоединялась последняя аминокислота.

Исходные вещества, используемые в синтезе pGlu-Gen-Gly-Ser-Asn
пара-метил-бензгидриламиновая смола
Вoс-Asn-α-О-бензил
Вос-Ser (Bze)
Boc-Gly
Boc-Gln (Xan)
p-Glu
При синтезе pGlu-Glu-Gly-Ser-Asn вместо Boc- (Xan) используют Вос-Glu (ОсНех).

Исходные вещества, используемые в синтезе pGlu-Gen-Gly-Ser-Asp:
Boc-Asp (OBzl)-смола
Boc-Ser (Bzl)
Boc-Gly
Boc-Gln (Xan)
pGlu
Для получения pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp вместо Boc-Gen (Xan) используют Boc-Glu (ОсНех).

Разложение фтороводорода:
Пептид, присоединенный к смоле, помещали в сосуд Kel-F и охлаждали до 0^оС. В качестве акцептора добавлялся анизол и жидкий фторводород вводился в систему и смешивался со смолой в течение 45 мин. Фторводород упаривался в вакууме в соответствии со стандартной методикой, предписанной поставщиком. Смола экстрагировалась простым эфиром для удаления акцептора и липофильных побочных продуктов. Неочищенный пептид экстрагировался в уксусную кислоту и воду.

Очистка упомянутых пептидов осуществлялась следующим образом.

Открытую стеклянную колонку заполняли смолой С-18, промытой ацетонитрилом.

Колонку предварительно обрабатывали буферным раствором А, который представлял собой 0,1% трифторуксусную кислоту, с использованием 500-1000 мл.

Пептид растворяли и добавляли в верхнюю зону колонки.

Линейный градиент начинали от 0% буферного раствора В до 100% В в течение 40 мин, причем буфером В был 60% ацетонитрил в А.

Пептид определялся с помощью ТСХ. Затем он подвергался ВЭЖХ, и наиболее чистые собирались и лиофилизировались.

Примечание:
ДЦК = дициклогексилкарбодиимид
Bzl = бензил
Xan = ксантил
ТФК = трифторуксусная кислота
ОсНех = циклогексилокси
Вос = трет-бутоксикарбонил
ЭЭДХ = N-этилоксикарбонил-2-этилокси-1-дигидрохинолин
БОФ = Бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)фосфоний- гексафторфосфат
Анализ.

Анализ pGlu-Gln-Gly-Ser-Asn мол. м. 515,44.

Тонкослойная хроматография: Кремнезем Fm (nBuOH : Pyr : HOAc : H₂O 15: 15: 3: 12) о-толидин
Результаты: Основное пятно с различным нижним пятном и ничтожным верхним пятном. Rf= 0,28; Кремнезем 1: 1: 1: 1 (nBuOH : EtOAc : : HOAc : H₂O) о-толидин; Результаты: Основное пятно с ничтожным верхним пятном и ничтожным нижним пятном. Rf = 0,22. Электрофорез: Ватман ЗММ, рН 3,5 (Pyr Ацетон); 1500 в; 1 ч; о-толидин; результаты: Основное пятно мигрирует в направлении анода с ничтожным нижним пятном. Rf = 0,25 с пикриновой кислотой в качестве эталона.

Аминокислотный анализ: % пептида 91,1%
Теория Найдено
Asp 1 1,09
Ser 1 0,92
Glu 2 2.01
Gly 1 0,98
Анализ pGlu-Glu-Gly-Ser-Asn молекулярная масса 516,42
Тонкослойная хроматография:
Силикагель Fm (nBuOH : Pyr : HOAc : H₂O, 15: 15: 3: 12) о-толидин;
Силикагель 1: 1: 1: 1 (nBuOH : EtOAc : HOAc : H₂O) о-толидин;
Результаты: Fm: Основное пятно с ничтожным нижним пятном, Rf = 0,44;
1: 1: 1: 1: Основное пятно с ничтожным нижним пятном, Rf = 0,39;
Электрофорез: Ватман ЗММ, рН 1,9 (НСООН : Ацетон); 1000 в; 1 час о-толидин;
Результаты: Единственное пятно, мигрирующее в направлении анода, Rf = 0,40 c пикриновой кислотой в качестве эталона. Аминокислотный анализ: % пептида 90,1% .

Теория Найдено
Asp 1 0,94
Ser 1 0,95
Glu 1 2,08
Gly 1 0,98
Анализ pGlu-Gln-Gly-Ser-Asn мол. м. 516,19 Тонкослойная хроматография:
Кремнезем Fm (nBuOH : Pyr : HOAc : H₂O, 15: 15: 3: 12) o-толидин;
Результаты: Основное пятно со слабым верхним пятном и ничтожным нижним пятном, Rf = 0,27;
Cиликагель 1: 1: 1: 1 (nBuOH : EtOAc : : HOAc : H₂O) о-толидин;
Результаты: Основное пятно с ничтожным верхним пятном и ничтожным нижним пятном, Rf = 0,32.

Аминокислотный анализ: % пептида 87,4% .

Теория Hайдено
Asp 1 0,98
Ser 1 0,91
Glu 2 2,06
Gly 1 0,97
Анализ pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp; молекулярная масса 517,18.

Тонкослойная хроматография:
кремнезем Fm (nBuOH : Pyr : HOAc : : H₂O, 15: 15: 3: 12) о-толидин,
Результаты: Основное пятно с ничтожным верхним пятном и ничтожным нижним пятном. Rf = 0,22.

Кремнезем: 1: 1: 1: 1 (nBuOH : EtOAc : : HOAc : H₂O) о-толидин.

Результаты: Основное пятно с ничтожным нижним пятном. Rf = 0,34.

Аминокислотный анализ: % пептида = 90,7% .

Теория Найдено
Asp 1 1,00
Ser 1 0,89
Glu 2 2,04
Gly 1 0,96
pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp
Данный пентапептид получают в растворе по методу с использованием активного сложного эфира с минимальной очисткой защищенных промежуточных соединений.

Реагентами являются Asp (OBzl₂; Boc-Ser(Bzl)-OSu;
Boc-Gly-OSu; Boc-Glu-(γ-OBzl)-OSu;
Cbz-[Glu-OSu; все они являются коммерчески доступными соединениям.

Boc-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂: (A)
Boc-Ser(Bzl)-OSu (1,2 экз. ), растворенный в минимальном количестве ДМФ, добавляют по каплям к перемешиваемому раствору Asp(OBzl)₂ (1 экз. ) в минимальном количестве ДМФ. Ход реакции контролируют с помощью ТСХ/Нингидрина. Негативный Нингидрин-тест показывает полное потребление соединения амина.

Растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в СН₂Сl₂ и экстрагируют 0,05 н. раствором H₂SO₄ (дважды), 1М NaHCO₃ (дважды), солевым раствором (один раз) и водой (один раз).

После сушки над сульфатом магния, фильтрования и упаривания растворителя в вакууме остаток растворяют в минимальном количестве CH₂Cl₂ и растирают со смесью простой эфир/петролейный эфир и хранят при температуре 4^оС в течение ночи. Осадок собирают и промывают холодной смесью простого эфира/петролейного эфира и сушат в вакууме. Выход неочищенного продукта составляет 95% .

Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂ ТФК (В)
Сырое соединение А растворяют в охлажденном на льду CH₂Cl₂ и разбавляют равным объемом ТФК. Реакцию контролируют с помощью ТСХ. Через 30 мин растворитель упаривают в вакууме, остаток повторно суспендируют в СН₂Cl₂ и упаривают в вакууме. Сырой продукт используют без дальнейшей очистки.

Boc-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl) (C)
Boc-Gly-OSu (1,2 экв. ), растворенный в минимальном количестве ДМФ, добавляют по каплям к перемешанному раствору продукта В (1 экв. ) и НЭМ (1 экв. ) в минимальном количестве ДМФ. Реакцию контролируют ТСХ/Нингидрином. Через 2 ч добавляют еще 0,2 экв. Boc-Gly-OSu и перемешивание продолжают в течение ночи.

Реакционная смесь теперь является Нингидрин-отрицательной по данным ТСХ, и сырой продукт обрабатывают описанным в части А способом. После растирания со смесью простого и петролейного эфиров неочищенный продукт используют без дальнейшей очистки. Выход неочищенного продукта составляет 85% .

Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂* ТФК (D)
Неочищенный продукт С обрабатывают охлажденным на льду раствором СН₂Cl₂/ИФК 1: 1, в течение 30 мин. ТСХ показывает полное потребление продукта С. Растворитель упаривают в вакууме, остаток повторно суспендируют в МеОН и упаривают в вакууме досуха. Сырой продукт D используют без дальнейшей очистки.

Boc-Glu(γ-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)₂(E)
Boc-Glu(γ-OBzl)-OSu (1,3 экз. ), растворенный в минимальном количестве ДМФ, добавляют к перемешанному раствору продукта D (1 экз. ) и НЭМ (1 экв. ) в минимальном количестве ДМФ. Ход реакции контролируют ТСХ/Нингидрином.

Растворитель упаривают в вакууме и сырой продукт обрабатывают с помощью приемов, описанных для А. Выход сырого продукта составляет 90% . Сырой продукт используют без дальнейшей очистки.

Glu(γ-Obzl)Gly-Ser-(Bzl)-Asp(OBzl)₂* ТФК (F)
Сырой продукт Е обрабатывают охлажденным на льду раствором СН₂Cl/ТФК, 1: 1, в течение 30 мин. Тонкослойная хроматография показывает полное потребление продукта Е. Растворитель упаривают в вакууме, остаток повторно растворяют в МеОН и упаривают досуха в вакууме. Сырой продукт F используют без дальнейшей очистки.

Cbz-pGlu-Glu(γ-OBzl)-Gly-Ser(Bzl)-
-Asp(OBzl)₂ (G)
Cbz-pGlu-OSu (1,3 экв. ), растворенный в минимальном количестве ДМФ, добавляют по каплям к раствору продукта F (1 экв. ) и НЭМ (1 экв. ) в минимальном количестве ДМФ. Ход реакции контролируют ТСХ/Нингидрином и перемешивание продолжают в течение ночи. Растворитель упаривают в вакууме, и сырой продукт обрабатывают, как описано для А. Сырой продукт очищают с помощью флеш-хроматографии с использованием CНCl₃/МеОН в качестве растворителя. Общий выход из А составляет 33% .

pGlu-Glu-Gly-Ser-Asp (H)
Очищенный продукт G растворяют в МеОН, и добавляют 10% Pd/C и аммонийформиат (5 экв. ). Прохождение реакции контролируют с помощью ТСХ, и через 45 мин исходное вещество полностью потребляется, а ТСХ явлется УФ₂₅₄-отрицательной. Катализатор удаляют с помощью фильтрования, растворитель упаривают в вакууме. Аммонийформиат удаляют лиофилизацией, и сырой продукт очищают и идентифицируют как соединение 4.

Дополнительные пояснения:
ДМФ = диметилформамид
Cbz = карбобензокси
Su = сукцинимидо
НЭМ= N-этилморфолин (56) Патент WO 87/00180, кл. С 07 К 7/06, опуб. 1987 г.

Паульсен Ян Эрик, Рейхельт Карл-Л. , Петерсен Анна К. Purification and characterization of a growth inhibitory hepatic peptide apreliminary note Verchows Arch/ B/ 54, 152- 154 (1987).

Использование: в биохимии и медицине. Сущность изобретения: пентапептиды общей формулы I где X₁, X₂ и X₃ каждый независимо представляет ОН или NH₂ при условии, что X₂ и X₃ оба не обозначают NH₂. При получении соединений формулы I используют классические методы синтеза пептидов в растворе и метод синтеза на твердой фазе с последующим снятием защитных групп от амино, амидо, гидроксила и/или карбоксила. Полученные соединения обладают способностью ингибировать рост клеток печени, практически не токсичны. 6 табл.

1. ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕНТАПЕПТИДОВ общей формулы

где X₁, X₂ и X₃ - каждый независимо OH или NH₂ при условии, что X₂ и X₃ оба не обозначают NH₂. 2. Пентапептид по п. 1, отличающийся тем, что X₁ - OH, X₂ - NH₂и X₃ - OH. 3. Пентапептид по п. 1, отличающийся тем, что X₁ - X₃ - каждый OH.