Способ получения полипептида, обладающего свойствами фактора высвобождения гормона роста Советский патент 1991 года по МПК C07K1/08 

Изобретение относится к биохимии, а именно к синтезу пептидов, оказывающих влияние на функцию гипофиза у людей и животных, главным образом к пептидам, стимулирующим высвобождение гормона роста гипофизом.

Целью изобретения является упрощение способа,,

Такие пептиды могут быть синтезированы твердофазным методом.

Способ заключается в том, что лабильные группы боковой цепи различных

аминокислотных фрагментов защищают с помощью подходящих защитных групп, которые препятствуют протеканию на данном участке химической реакции до тех пор, пока защитная группа не буг. дет полностью удалена. Традиционным приемом является защита альфа- аминогруппы аминокислоты или фрагмента во время реакции системы по карбоксильной группе, после осуществляют селективное удаление альфа-аминозащитной группы для про

ы

J1

ведения последующих реакций, в соответствии с этим получают промежуточные соединения, которое включают ами нокислотные остатки, расположенные в требуемой последовательности в пептидной цепи, где к соответствующим остаткам присоединены защитные груп- пы боковой цепи, где ВОС трет-бу- тилоксикарбонил; МВПА - смола;

ОБ21 - эфиро-образующая защищающая группа для карбоксильной группы, та кая как Asp или Glu; Bzl - бензилв гидроксилзащищающая группа для Serj Хап - защищающая группа для амидо- группы, такой как ксантил; TOS - защитная группа для имидазольного азота

Пример 1„ Синтез пептида Ser 7, 8, 19 Ala 9, 15, 18, 28, Arg 12, 21, Leu 13,26, 27 - hGRF (1-29)- NIi2, отвечающего формуле H-Tyr-Ala, Asp-Ala- Ile-Piie S er-S er-Ala-Туг-Arg- -Arg-Leu-Leu-Ala-Glu-Leu-Ala-Ser- -Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-

-Ala-Arg-NIL, осуществляют ступенчато с использованием Beckman 990 пептидного синтеза на смоле МВНА. имею щей интервал замещения 0,35- 0,5 ммоль/г смолы Соединение ВОС- Aig (TOS) со смолой осуществляют по общей методике, описанной в патенте США К 4292313 (Vale), с использованием КР в среде ДМФ при 60°С в тече- ние 24 ч при перемешивании В результате достигают замещение, равного 0,35 ммоль Arg на 1 г смолы

После деблокирования и нейтрализации пептидную цепь постадийно выстраивают на смоле Деблокирование нейтрализацию и добавление каждой аминокислоты осуществляют в соответсвии с общей методикой. Все используе мые растворители тщательно дегазирую путем продувки инертным газом, напри мер гелием или азотом, с тем, чтобы обеспечить отсутствие кислорода

Деблокирование проводят в соответствии с режимом А, мин:

60% ТФА/20% этандитиолЮ

60% ТФА/2% этандитиол15

1РА/1% этандитиол0,5

Et3N (10%) в CHgClfc0,5

МеОН0,5

Et3N (10%) в CHgClj,0,5

МеОН (дважды)0,5

CHZC12 (дважды)0,5

Операции сочетания проводят в соо ветствии с режимом В, мин:

,«

2Q 5

™

.

35

40

0

5

ДСС1

ВОС-аминокислота50-90

МеОН-(дважды)0,5

СНгС1г (дважды)0,5

Ас20 (ЗМ) в СН2С1г15,0

.0,5

heOH0,5

CHgClg. (дважды)0,5

Описанные операции сводятся к следующему: 1-2 ммоль ВОС-защищенной аминокислоты в среде хлористого метилена используют на 1 г смолы, до- бавляют 1 экв, 1,0 М раствора ДСС1 в хлористом метилене в течение 2 ч В том случае, когда сочетанию подвергают BOC-Arg (TOS), используют смесь 50% ДМФ и хлористого метилена. В качестве защитной группы гидроксила боковой цепи Ser и Thr используют бензиловый эфир. Амидогруппу Asn и Gin защищают с помощью Хап в том случае, когда применяют ДСС сочетание, это является предпочтительным

n-Нитрофениловый эфир (ONp) можно использовать для активации карбоксильного конца Asn или Gin и, например, BOQ-Asn (ONp) можно подвергать конъюгированию в течение ночи с использованием 1 экв. HOBt в 50%-ной смеси ДМФ и хлористого метилена, и в этом случае ДСС не добавляют. Для боковой цепи Lys в качестве защитной группы используют 2-хлор-бензилокси- карбонил (2C1-Z)0 Tos используют для защиты гуанидиногруппы Arg, а также имидазольного азота His, а карбоксильную группу боковой цепи Glu или Asp защищают с помощью OBZ1. Феноль- ную гидроксильную группу Туг защищают 2,6-дихлорбензилом (ДСВ). К концу синтеза получают следующую композицию: BOC-Tyr (x )-Ala-Asp(X2)- -Ala-Ile-Phe-Ser-(X3)-Ser-(X3)-Ala- - Ту г (X ) -Arg (X f)-Arg (Xr)-Leu-Leu- (X4)-Leu-Ala-Ser(X3)-Arg(X)- -Arg(X)-Leu-Leu-Gln-(X4)-Glu(Xe)- -Leu- Leu-Ala-Arg (X )-X , где X - ДСВ; Хг - OBZ1; X - Bzl, X - Xan; TOS; X - подложку - HN-смолы

Xan полностью или частично удаляют обработкой ТФА, используемой для деблокирования а-амино защитной группы.

51

Для расщепления и снятия защитнай группы с системы пептид-смола послед нкю обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на } г системы пептид смол а в течение 0,5 ч при -20°С и в течение 0,5 ч при 0°С. Йосле удаления HF в высоком вакууме оставшуюся систему пептид-смола попеременно промывают сухим диэтиловым эфиром и хлороформом и затем пептид экстрагируют дегазированной 2Ы уксусной кислотой и отделяют от смолы фильтрацией.

Затем отщепленный и лишенный защитной группы пептид растворяют в 0-5%-ном растворе уксусной кислоты и подвергают очистке, которая может включать стадию фильтрации через мелкозернистый гель Сефдцекс С-50

Затем пептид подвергают дополнительной очистке методом препаративной или полупрепаративной жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPIC). Состав хроматографич - ских фракций тщательно регулируют с помощью HPIC и сливают лишь те фракции, которые имеют достаточную чистоту. Обессоливание очищенных фракций независимо проверенных на частоту достигается с использованием градиента в 0,1%-ной ТФА. Затем центральный разрез подвергают лиофилиза- ции с образованием желаемого пептида имеющего чистоту выше 98%

Пример 2. Синтез пептида, имеющего ту же последовательность аминокислотных остатков, но в виде свободной кислоты, т.е. Ser 7,8,19, Ala 9,15,18,28, Arg 12,21, Leu 13, 26,27 - GPF (, отвечающего формуле:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser -Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln- -Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Glu- -Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-OH, проводят ступенчатым методом с использованием пептидного синтезатора Beckman 990 на хлорметилированной смоле, имеющей интервал замещения 0,35-0,5 ммоль/г смолы.. Соединение ВОС-Arg (TOS) со смолой проводят согласно общей методике, используя в качестве растворителя хлористый метилен, в течение 2 ч при перемешивании, добавляют 1 экв. 2М раствора ДСС1 в хлористом метилене. В результате достигают степень замещения

87

порядка 0,35 ммоль Arg на г смолы, Остальные операции синтеза, включаю щие расщепление, снятие защитной группы и очистку, проводят согласно

примеру 1.

В соответствии с анализом, выполненным методом тонкослойной хроматографии и HPIC, установлено, что

получен практически чистый пептид нового типа.

X1 может представлять собой подходящую защитную группу для феноль- ной гидроксильной группы тирозина

(Туг), например, такую как тетрагид- ропнранил, трет-бутил, тритил, Bzl, CBz, -CBz и 2,6-дихлорбензил (ДСВ). Предпочтительной защитной группой является 2,6-дихлорбензил

X может представлять собой водород, что означает отсутствие защитной группы в боковой цепи аминокислотного остатка в этом положении. Xz представляет собой водород или подходя-

щую эфирообрузующую защитную группу для карбоксильной группы аспаргина (Asp) или глутамина (Glu), такую как бензил (OBzI), 2,6-дихлорбензил, метил или этил

X может представлять собой подходящую защитную группу для гидро- ксильном группы треонина (Tlir) или серила (Ser), например Bzl, 2,6-ди- хлорбензил и CBz. Предпочтительной

защитной группой является Bzl,

X может представлять собой водород, что (тодразумевает отсутствие защитной группы на гидроксильной группе. X представляет собой водород

или подходящую защитную группу для амидогруппы боковой цепи Ash или глицина (Gin). Предпочтительно, такая группа представляет собой ксан- тил (Хап).

5 X представляет собой подходящую защитную группу для гуаниднно-группы аргинина (Arg), такую как нитро-TOS, CBz, адамантилоксикарбонил, а также ВОС или водород.

Выбор группы для защиты аминогруппы боковой цепи не имеет решающего значения за исключением того, что обычно выбирают такую группу, которая не удаляется в ходе операции

по снятию защитной группы у аминогрупп в ходе синтеза. Однако для некоторых аминокислот,, например гисти- дина (His), обычно нет необходимости в защите после завершения соединения

и в этом случае защитные группы мо- гут быть одинаковыми

X представляет собой подходящую защитную группу для С-терминальной карбоксильной группы или представляе собой якорную связь, используемую в твердофазном синтезе для при сое дине ния к подложке из твердой смолы, или представляет собой des-X1 в том слу- чае, когда осуществляют амидирование Arg остатка по С-окончанию, В том случае, когда используется такая под ложка из твердой смолы, она рассмат- ривается как защитная группа и, соот- ветствующие защитные группы такого типа могут быть выбраны из следую щих систем: О-СН -синтетическая подложка, -Ш-бензгидриламин (ВНА)- синтетическая подложка, или -NH-napa метилбензгидриламин (МВНА) - синтетическая подложка В том случае, когда на С-окончании желательно на- личие незамещенной амидной группы используют ВНА или МВНА, поскольку расщепление непосредственно приво- дит к образованию амидной группы.

Твердофазный синтез начинается С С-терминального конца пептида путем конъюгации защищенной а-амино- кислоты с подходящей смолой Такой исходный материал может быть получен путем присоединения а-амино-защищенной аминокислоты посредством эфирной связи к хлорметилированной смоле или гидроксиметилированной смоле, или посредством амидной свя- зи к ВНА смоле или МВНА смоле.

С-Терминальная аминокислота, защищенная ВОС и TOS, может быть вна- чале конъюгирована с хлорметилиро- ванной смолой или с ВНА или МВНА смолой. После коньюгации ВОС-защищенной аминокислоты с подложкой из смолы а-амино-защищающую группу уда- ляют, например, путем использования трифторуксусной кислоты (TFA) в среде хлористого метилена или только TFA. Снятие защитной группы проводят при температуре от 0°С до комнатной температуры.

Каждая защищенная аминокислота или аминокислотная последовательност вводится в твердофазньй реактор в, примерно четырехкратном или более высоком избытке и коньюгирование может осуществляться в среде, представляющей соиоч смесь диметилформамлда (ДМФ) и (1:П или каждое из

д 15 20 25

30 $

40 45

50

5

указанных веществ в отдельности„ В тех случаях, когда имеет место неполное коньюгирование, операцию повторяют до удаления а-аминозащитной группы перед присоединением следующей аминокислоты. Степень протекания реакции сочетания на каждой стадии синтеза, если реакцию проводят вручную, предпочтительно регистрируется нингидриновой реакцией,, Реакции сочетания могут проводиться в автоматическом режиме, например, в Бекманов- ском автоматическом синтезаторе 990.

После завершения желаемой последовательности аминокислот промежуточный пептид может быть удален с подложки из смолы в результате обработки таким реагентом, как жидкий фтористый водород, который не только отщепляет пептид от смолы, но также отщепляет все оставшиеся защитные группы боковой цепи Х X2-, X э, X4, Xs, а также а- амин защитнук группу, с получением амидированного пептида. ВОС-защищающую группу удаляют вначале с использованием системы трифторуксусна я кислота - этачдитиол до отшепления пептида от смолы с помощью HF. При использовании для расщепления фтористого водорода в реакционный сосуд в качестве акцепторов вводят анизол и метилэтилсульфид

Формула изобретения

Способ получения полипептида, обладающего свойствами фактора высвобождения гормона роста, БКЛКГ чающий очистку конечного продукта, отлич ающий ся тем, что, с целью упрощения способа, осуществляют твердофазный синтез пептида фо рмулы

H-Tyr-Ala-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala- -Туr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gin-Leu- -Ala-Ser-Arg-Arg-Leur Leu-Gin-Glu- -Leu-Leu-Ala-Arg-Y, где Y - ОН или Н -группа, путем соединения ВОС-защищенных ами нокислот с МВНА или хлорметилированной смолой для образования пептида, имеющего одну защитную группу ВОС; -Туг(Х)-Ala-Asp(X2)-Ala-Ile-Phe- -Seir(X3)-Ser(X)-Ala-Tyr(X )-Arg(Xr)- -Arg(X5)-Leu-Leu-Ala-Gln(X4)-Leu- -Ala-Ser(X5)-Arg(X5)-Arg(Xf)-Leu- -Leu-Gln(X4)-Glu(X)-Leu-Leu-Ala- -Arg(Xr)-X9,

9 1651787Ю

где X, - 2,6-лихлорбензил,групп и отрывом пептида от полимер

2. OBzl;ного носителя с помощью смеси, со

Xj - Bzl;держащей 1.5 мл анизола, 0,5 мл ме

X 4- ап тилэтилсульфида и 15 мл фтористого

Xf ЮЗ; водорода в расчете на I г системы

Х - связь с полимерным носите- пептид - смола в течение 0,5 ч при

лем,. с последующим отщеплением защитных

Изобретение относится к биохи- мии, а именно синтезу полипептидов, стимулирующих высвобождение гипофиз..ого гормона роста у животных. Цель изобретения - упрощение способа. Способ заключается в том, что проводит твердофазный синтез пептида формулы H-Tyr-Ala-Asp-Ala-ILe-Phe-Ser- -Ser-Ala-Туг-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala- -Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu- -Gln-Glu-Leu-Leu-A a-Arp,-v, гле v -представляет собой ОН или Н группу путем соединения ВОС-замещенных аминокислот с подложкой из смоль:. Для образования пептида проводят последовательно блокирование и деблокирование боковой цепи, причем для блокирования выбирают защитную группу в зависимости от аминокислоты на конце боковой цепи. Отщепление -защитныхi групп и отрыв полипептида от смолы проводят смесью 1,5 мл анизола, 0S5 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода в расчете на 1 г системы пептид-смола в течение 0,5 ч /при 0-20° С. (Л