Изобретение относится к физической химии и криобиохимии и может найти применение при изучении механизмов замораживания - оттаивания, при консервировании сыворотки и клеток крови, тканей и органов.
Известен спектрофотометрический способ определения активности ферментов в переохлажденных растворах. Способ заключается в том, что реакцию проводят в переохлажденной среде, содержащей органические растворители (этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль, ДМСО), точка замерзания которой ниже 0оС.
Этот способ не позволяет определять фосфодиэстеразную активность непосредственно в замороженном биологическом материале.
Известен способ определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, согласно которому в биологический материал вводят нефлуоресцирующее вещество - флуоресцеиндиацетат, замораживают и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуоресцеина, по которой судят об активности эстеразы. Однако этот способ вообще не позволяет определять активность дифосфоэстеразы.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности фосфодиэстеразы, основанный на расщеплении цАМФ змеиным ядом до биологически неактивного 5'-АМФ при инкубации в течение 10 мин при 37оС. Активность фермента определяют методом Фиске-Суббароу на спектрофотометре при 660 нм.
Недостатком способа является то, что он не позволяет определять активность фосфодиэстеразы непосредственно в замороженном биологическом материале.
Целью изобретения является определение активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале.
Поставленная цель достигается тем, что в способе определения активности фосфодиэстеразы в биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон при концентрации 10-6-10-7 М и по снижению флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы.
Способ осуществляют следующим образом. В биологический материал (суспензия клеток, гомогенат клеток тканей и органов) вводят субстрат реакции циклический аденозин-3', 5' монофосфат и умбеллиферон в концентрации 10-6-10-7 М. Пробы замораживают и определяют интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 ± 1 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442± 1 нм.
Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата (см. табл.1).
Из табл. 1 следует, что оптимальными концентрациями являются 10-6-10-7 М. При концентрации 10-5 М присутствует нерастворимый осадок умбеллиферона, а при концентрации 10-8 М чувствительность способа существенно снижается, что не позволяет достоверно судить о ходе реакции.
Способ иллюстрируется следующим примером. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Hitachi MPF2a (Япония) в кварцевых кюветах объемом 3 мл. В качестве среды инкубации использовали 3 мл солевой среды, содержащей 5 ммоль MgCl2 и 40 ммоль NaCl. В этот объем вносили 50 мкл биологического материала, 50 мкл цАМФ (конечная концентрация 1,9 мМ) и 20 мкл умбеллиферона (конечная концентрация 10-6 М) и сразу замораживали в парах жидкого азота до -10оС. После этого измеряли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм.
Данная величина интенсивности флуоресценции служила в качестве контроля фосфодиэстеразной реакции. Через 24 ч хранения при -10оС определяли интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 350 нм и максимуме длины волны флуоресценции 442 нм. Эту операцию повторяли дважды через 24 ч хранения при -10оС. В случае осуществления фосфодиэстеразной реакции при комнатной температуре (20оС) по такой же схеме, она полностью завершалась через 20 мин инкубации.
Полученные данные приведены в табл.2.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ определения эстеразной активности в биологическом материале | 1982 |
|
SU1067442A1 |
| Способ определения концентрации гемоглобина | 1981 |
|
SU1097951A1 |
| Способ определения гликолей | 1984 |
|
SU1272247A1 |
| СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ | 1990 |
|
RU1775882C |
| Способ определения степени повреждения эритроцитов | 1987 |
|
SU1663549A1 |
| Способ определения жизнеспособности тканей | 1983 |
|
SU1172511A1 |
| Способ определения криозащитных свойств консерванта для длительного хранения эритроцитов | 1989 |
|
SU1738198A1 |
| Устройство для замораживания и отогрева биологических объектов | 1982 |
|
SU1110430A1 |
| Способ определения повреждения органов | 1983 |
|
SU1146000A1 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ БИОМАТЕРИАЛОВ | 1991 |
|
RU2013720C1 |
Использование: в физической химии и криобиологии, для определения активности фосфодиэстеразы (ФДЭ) в замороженном биологическом материале. Сущность изобретения: в биологический материал перед замораживанием вводят умбеллиферон в концентрации 10-6-10-7 М, ц= АМФ, и определяют интенсивность флуоресценции при длине возбуждения 350 нМ и максимуме волны флуоресценции 442 нМ. Интенсивность флуоресценции находится в обратной зависимости от количества расщепленного субстрата. Способ позволяет измерять активность ФДЭ в замороженном материале. 2 табл.
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, отличающийся тем, что, с целью определения активности фосфодиэстеразы в замороженном биологическом материале, в него перед замораживанием вводят умбеллиферон в конечной концентрации 10-6 - 10-7 М и по снижению интенсивности флуоресценции умбеллиферона определяют активность фосфодиэстеразы.
