Способ определения криозащитных свойств консерванта для длительного хранения эритроцитов Советский патент 1992 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для быстрого определения криозащитных свойств консерванта эритроцитов.

Известен способ выбора консерванта, основанный на анализе эвтектических характеристик водного раствора криопротекто- ра, как основного компонента консерванта. Для анализа эвтектических характеристик строят диаграммы плавкости системы вода - криопротектор, и криопротектор считывается тем лучше, чем ниже температура плавления эвтектической смеси.

Недостатком известного способа является его длительность и сложность, которые обусловлены рядом факторов. Построение диаграммы плавкости криопрЗектор - вода во всем диапазоне концентраций - процедура длительная и трудоемкая, растягивающаяся, как правило, на месяцы.

Многие из известных эффективных кри- опротекторов обладают свойствами стекловаться при охлаждении, что затрудняет нахождение эвтектических температур и концентраций.

Так, глицерин обладает свойством стекловаться в водных растворах при концент- рации более 40% и поэтому найти температуру кристаллизации эвтектической смеси с достаточной степенью точности сложно. Состав, близкий к ёвтектическому, не кристаллизуется даже при весьма длительных выдержках в соответствующей зоне температур. Аналогичным свойством обладают и другие криопротекторы: 1, 2 про- пандиол, полиэтиленгликоль и т.д.

Х| СО 00

А

ю

00

На диаграммах плавкости таких систем обычно линия ликвидуса, отвечающая температурам кристаллизации криопритектора, не регистрируется, и найти эвтектическую температуру и концентрацию таких систем трудно.

Цель изобретения - сокращение времени анализа криозащитных свойств консерванта и упрощение способа.

Способ осуществляется следующим об- разом.

Эритроциты, отмытые от плазмы, смешивают с консервантом и замораживают до - 196°С.

Затем образцы нагревают до темпера- туры стеклования (Тс) криозащитной среды и повторно замораживают до -196°С.

Такое периодическое изменение температуры осуществляют 5-15 раз под контролем дифференциального сканирующего калориметра. После образцы размораживают и нагревают на водяной бане до +45°С и оценивают степень повреждения эритроцитов по уровню гемолиза.

Уровень гемолиза, выявленный после однократного замораживания образца в консерваторе до - 196°С и нагревания до +45°С, принимают за исходный.

Пример. Донорскую кровь человека, полученную на глюгицире, центрируют при 800 втечение 5 мин. отделяют плазму Полученные эритроциты смешивают с консервантом на основе глицерина в соотношении 1:2, с другими консервантами 1:1.

А. Пропандиосахароль содержит в мас.%:

1,2-пропандиола 35, сахарозы 3, хлористого натрия 0,7 и воды 61,3.

Гемолиз эритроцитов в данном консерванте в исходе и после 5, 10 и 15 циклов изменения температуры от -196 до -110°С, %: 0,7,1,05, 1,33 и 1,65 соответствен но.

П р и м е р 2. Донорские эритроциты смешивают с консервантом на основе по- лиэтиленгликоля (ПЭГ) в соотношении 1:1,

Б. Консервант с ПЭГ молекулярной массы 1500 содержит в мас.%: ПЭГ1500

25, хлористый натрий 0,7 и остальное - вода.

Гемолиз эритроцитов в исходе и после 5, 10 и 15 циклов изменений температуры консерванта от -196°С до Тс (до -75°С для данного консерванта) составил , %: 5,35. 9,33, 9,83 и 10,0.

П р и м е р 3. Донорские эритроциты смешивают с консервантом на основе глицерина в соотношении 1:2.

В. Консервант, мас%: глицерин 60, вода 40, температура стеклования - 114°С.

Гемолиз эритроцитов в исходе и после 5, 10, 15 циклов изменений температуры консерванта от- 196°С до -114°С равны. %: 1,17, 7,5, 8,66 и 9,33.

П р и м е р 4. Донорские эритроциты смешивают с консервантом в соотношении 1:2.

Г. Состав консерванта: маннит 40,0 г, хлористый натрий -7,0 г, цвузамещенный фосфорнокислый натрий 0,3 г, глицерин - 400 мл, вода бидистиллированная до 1 л.

Температура Тс равна -108°С. Гемолиз эритроцитов в исходе и после 5, 10 и 15 циклов изменений температуры консерванта от -196°С до -108°С составил, %: 4,5; 5,67; 7,0 и 8,66.

Применение способа позволяет упростить анализ криозащитных свойств различных консервантов для длительного хранения эритроцитов и сократить время анализа до 10-12 ч.

Формула изобретения

Способ определения криозащитных свойств консерванте для длительного хранения эритроцитов, включающий преинку- бацию клеток в криозащитной среде, замораживание-оттаивание и последующее определение уровня гемолиза, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и упрощения способа, гемолиз эритроцитов определяют после периодических 5-15-кратных изменений температуры замороженного образца в диапазоне от -196°С до температуры стеклования консерванта.

Способ определения криозащитных свойств консерванта для длительного хранения эритроцитов. Использование: для быстрого определения криозащитных свойств консерванта эритроцитов. Цель : сокращение времени анализа и упрощение способа. Сущность изобретения: путем многократного (до 15 р.аз) замораживания до - 196°С и нагревания смеси консерванта с эритроцитами до температуры стеклования консерванта и последующего нагрева до 45°С смеси, в которой определяется степень повреждения эритроцитов по уровню гемолиза. Положительный эффект: применение способа позволяет упростить анализ криозащитных свойств консервантов дли длительного хранения эритроцитов и сократить время анализа до 10-12 ч.