Способ определения эстеразной активности в биологическом материале Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

1 Изобретение относится к физическоо. химии и криобиохимии и может найти применение при изучении процессов замораживаний - оттаивания/ а также пои консервировании сыворот ки и клеток крови, органов и тканей и в пищевой промышленности. Известен спектрофотометрический способ определения активности ряда ферментов в переохлажденных растворах, заключающийся в том, что реакцию проводят в переохлажденной сред содержащей органические раствори.тел (этиленгликоль, метанол, пропиленгликоль/ ДМСр и другие ), точка замерзания которой ниже flj. Однако этот способ не позволяет определить активность ферментов непосредственно в замороженном состоянии. Известен также способ определения активности инвертазы при замораживании биологического объекта с различной скоростью и до различных температур, при котором замороженный биологический материал огтаивают и затем колориметрически определяют активность инвертазы CSJ. Этот способ также не позволяет определять активность фермента непосредственно в замороженном биологическом материале. Целью изобретения является определение активности эстеразы в замороженном биологическом материале. Поставленная цель достигается тем, что сог-ласно способу определения активности эстеразы в биологичемком материале путем физико-химического анализа пробы, в него перед .замораживанием вводят флуоресцеиндипропйонат в конечной концентрации 10 .и по нарастанию интенсивности флуоресценции образующегося флуоресцеина определяют активность эстеразы. Способ осуществляют следующим образом. В биологический материал (суспензия клеток, гомох енат клеток, суспензия лизосом ) вводят нефлуорес цйрующее соединение - флуоресцеинд пропионат - в конечной концентрации 10 М, пробы сразу замораживают и определяют интенсивность флуоресценции образующегося флуорес цеина при длине волны возбуждения Д( 486+1 нм и максимуме длины волны флуоресценции Лф 517+1 нм. Интенсивность флуоресценции находится в прямой зависимости от количества флуоресцеина, являющегося продуктом эстеразной реакции,. П р и м е,р 1. К 3,0 мл; дистилли рованной воды добавляют 20 мкл суспензии лизосом (40 Мг белка/мл), вы деленных из изолированных клеток печени крыс. В разведенную суспензи лизосом добавляют флуоресцеинди2пропионат в конечной концентрации и сразу жезамораживают в парах жидкого азота до . После этого измеряют интенсивность флуоресценции фпуоресцеина при длине волны возбуждения А 486 нм и мак симуме длины волны флуоресценции Л ф 517 нм. Величина интенсивности флуоресценции служит в качестве контроля эстераэной реакции. Через 30 мин хранения при -10°С определяют интенсивность флуоресценции при длине .486 нм и макволны воз 5уждения /t симуме длины волны флуоресценции Дф 517 нм. Эту операцию повторяют через 30 мИн в течение последующих 1,5 ч хранения при . В случае осуществления эстеразной реакции при комнатной температуре (+20.°С) по такой же схеме она полностью завершается через 10 мин инкубации. Максимальный уровень флуоресценции одинаков в обоих случаях. Полученные данные приведены в табл. 1. -t IТаблица П р и м е р 2. Проводят аналогично примеру 1, но при конечной концентрации флуоресцеиндипропионата Ю М. Полученные данные приведены в табл. 2. / , . Таблица2.

J1067442 .

Продолжение табл.2 Предлагаемый способ позволяет

60 - 46 в результате астеразной реакции,

90 48 5 реакции в замороженном биологическом 120 50 тики. ,

по возрастанию интенсивности флуоресценции флуорёсцеина, образующегося

судить о ходе и скорости эстеразной

материале от ОС до температур эвтек

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗЫ В БИОЛОП1ЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем физико-химического анализа пробы, о т л. и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью определения активности эстеразы в замороженном биологическом материале, в него перед замораживанием бводят флуоресцеиндипропионач в конечной концентрации и по .нарастанию интенсивности флуоресценции образующегося флуоресцеина определяют активность эстеразы. §