ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ УГНЕТАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА МИОКАРД Российский патент 1994 года по МПК A61K37/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и может быть использовано для получения низкомолекулярного средства, обладающего угнетающим действием на миокард.

Известен низкомолекулярный фактор, выделенный из плазмы крови интактных мышей и кошек, перенесших геморрагический шок, угнетающий миокард при введении его другим животным [1].

Доказано, что специфическое угнетающее миокард действие данного фактора связано с пептидом мол.м. 800-1000 дельтон [2].

Целью изобретения является расширение арсенала низкомолекулярных средств эндогенного происхождения, оказывающих угнетающее действие на миокард.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве средства, оказывающего угнетающее действие на миокард, используют фракцию эндогенных низкомолекулярных веществ, выделенную гель-хроматографией из диализатов сыворотки крови и водно-солевых экстрактов внутренних органов животных мол.м. 300 дальтон, характеризующейся максимума поглощения при 236 и 292 нм.

1. Метод и источники выделения предлагаемого средства, обладающего угнетающим действием на миокард.

П р и м е р 1. Тотальным кровопусканием из бедренной артерии под местной анестезией 0,25%-ным раствором новокаина забивают интактную собаку. Для исследования берут кровь, миокард, печень, тимус, селезенку, брыжеечные лимфатические узлы. Навески органов гомогенизируют в гомогенизаторе типа РТ-2 при добавлении 5-кратного объема (масса объема) охлажденного 0,14 М раствора хлорида натрия рН 7,2-7,4 и экстрагируют в течение 8-12 ч при 2-4^оС.

Экстракты гомогенатов отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Сыворотку крови получают одним из известных способов. Все дальнейшие операции проводят на холоду при 2-4^оС.

Сыворотку крови и экстракты гомогенатов внутренних органов подвергают диализу через полупроницаемую мембрану для отдельных крупномолекулярных примесей против 5-10-кратного объема (объем/объем) 0,14 М раствора хлорида натрия рН 7,2-7,4. Диализаты собирают, концентрируют, например выветриванием в целлофановых кульках или упариванием в вакууме, до исходного объема сыворотки крови или гомогената органа и подвергают гель-хроматографическому разделению на колонках, заполненных сефадексом G-15 и стабилизированных 0,14 М раствором хлорида натрия рН 7,2-7,4. Элюцию проводят 0,14 М раствором хлорида натрия рН 7,2-7,4. Элюент собирают порционно, например, при помощи автоматического коллектора сбора фракций ХКОВ - 1. Выход материала контролируют по оптической плотности при длине волны 280 нм в каждой отдельной пробе элюента на спектрофотометре, например СФ-16, и строят график кривой элюции (гель-хроматограмму). Пробы элюента, входящие в пики, объединяют и регистрируют на спектрофотометре, например "Спекорд М-40", спектры поглощения каждого пика (фракции) в ультрафиолетовом излучении (220-330 нм) с интервалом измерений 2 нм. Определяют максимумы поглощения, характерные для каждой из выделяемых фракций. Раствор сравнения - деминерализованная вода. Выход отдельных фракций определяют, соотнося их объем элюции к свободному объему колонки (V_o). Фракцию, элюирующуюся с колонок в объеме 5,0-6,0 V_o и характеризующуюся максимумами поглощения при 236 и 292 нм, используют в качестве средства, обладающего угнетающим действием на миокард. Количественное содержание данной фракции в подвергнутых исследованию биосубстратах интактных собак представлено в таблице.

П р и м е р 2. Тотальным кровопусканием из бедренной артерии под местной анестезией 0,25% -ным раствором новокаина забивают собаку через 1 ч после применения острого стрессового воздействия, моделируемого внутривенным введением антицитохромоксидазной сыворотки против фермента цитохромоксидазы, выделенного из миокарда собак.

Для исследования берут кровь, миокард, печень, тимус, селезенку, брыжеечные лимфатические узлы. Указанные биосубстраты подвергают обработке, аналогичной примеру 1. Количественное содержание фракции, элюирующей в объеме элюции 5,0-6,0 V_o и характеризующейся максимума поглощения при 236 и 292 нм в подвергнутых исследованию биосубстратах собак, перенесших острое стрессовое воздействие, представлено в таблице.

П р и м е р 3. Декапитацией забивают 3-5 крыс-самцов, подвергнутых фиксации в положении на спине в течение 6 ч (эмоционально-болевое стрессорное воздействие. Для исследования берут кровь, миокард, печень, тимус, селезенку и брыжеечные лимфатические узлы, которые подвергают обработке, аналогичной примерам 1 и 2. Количественное содержание фракции, содержащей средство, обладающее угнетающим действием на миокард, в подвергнутых исследованию биосубстратах крыс, перенесших острое стрессорное воздействие, представлено в таблице.

П р и м е р 4. Декапитацией забивают 3-5 интактных крыс-самцов. Для исследования берут кровь, миокард, печень, тимус, селезенку и брыжеечные лимфатические узлы, которые подвергают обработке, аналогичной примерам 1-3. Количественное содержание фракции, содержащей средство, обладающее угнетающим действием на миокард, в подвергнутых исследованию биосубстратах интактных крыс представлены в таблице.

Из данных, представленных в таблице, следует, что наибольшие количества фракции низкомолекулярных веществ, обладающих угнетающим действием на миокард, содержится в селезенке, лимфатических узлах и сыворотке крови интактных собак и крыс. После перенесенного острого стрессорного воздействия отмечается отчетливое перераспределение содержание данной функции во внутренних органах - резкое снижение до следовых количеств в селезенке и лимфоузлах и увеличение в миокарде, тимусе и печени при практически неизменном ее уровне в сыворотке крови. При этом увеличение содержания фракции, обладающей угнетающим действием на миокард, в сердечной мышце при остром стрессорном воздействии наблюдалось значительно раньше (по времени) и сохранялось дольше, чем в тимусе и печени, что позволило рассматривать данный феномен как избирательное накопление фракции низкомолекулярных веществ в сердечной мышце при остром стрессорном воздействии.

II. Физико-химические свойства и характеристики предлагаемого средства, обладающего угнетающим действием на миокард. Гель-фракция на сефадексе G-15. При гель-хроматографическом разделении диализатов сыворотки крови и водно-солевых экстрактов гомогенатов внутренних органов животных на колонках, заполненных сефадексом G-15 в описанных условиях, фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, элюируется в объеме элюции 5,0-6,0 V_о.

Определение молекулярной массы. Для калибровки гель-хроматографичеких колонок используемых для выделения из биосубстратов фракции, обладающей угнетающим действием на миокард, использовали вещества мол.м. меньше 1500 дальтон (предел эксклюзии сефадекса G-15/АТФ/MM = 507,19/ тиамин /MM = 435,20/, морфин /MM = 285,33/ и валин /MM = 117,15/. Выход маркерных веществ с колонки детектировали по максимуму их поглощения в ультрафиолетовом излучении (260, 264, 286 и 220 нм соответственно). Он составил 1,5-2,0; 3,3-4,0; 4,6-5,5 и 6,5-7,5 V_o соответственно. Эти данные свидетельствуют, что молекулярная масса фракции низкомолекулярных веществ, обладающей угнетающим действием на миокард, составляет около 300 дальтон, поскольку она элюируется в объеме элюции большем, чем тиамин, меньшем, чем валин и близком к таковому у морфина.

Спектроскопия в ультрафиолетовом излучении. Фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, обладает следующими особенностями поглощения в ультрафиолетовом излучении: - в нейтральном водно-солевом растворе (0,14 М раствора хлорида натрия рН 7,2-7,4) максимума поглощения при 236 и 292 нм; - при закислении водно-солевого раствора добавлением 0,1 н. HCl отмечается достоверный сдвиг первого и второго максимумов поглощения в более коротковолновый участок спектра - 230 и 284 нм; - при защелачивании водно-солевого раствора добавлением 0,1 н. NaOH происходит потеря первого максимума поглощения и сохраняется второй при 284 нм.

Инфракрасная спектроскопия. Лиофильно высушенная фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, запрессованная в таблетки с KBr, характеризуется полосами поглощения в области 924-928; 989-997; 1000-1200; 1400; 1480-1550-1600-1660; 1740-1750; 3280-3350 и 3380 см^-1. Это дает основание полагать, что фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, является, вероятно, низкомолекулярным (коротким) пептидом, включающим в свой состав до 3 аминокислотных остатков.

Условия хранения. Фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, сохраняет свое биологическое действие при хранении в условиях холодильника (2-4^оС) в течение 3-7 сут, а при хранении в замороженном состоянии при от -20 до -40^оС в течение 2-3 мес (срок наблюдения).

III. Биологическое действие предлагаемого средства обладающего угнетающим действием на миокард.

Биологическое действие фракции низкомолекулярных веществ, используемой в качестве средства, обладающего угнетающим действием на миокард, полученной из перечисленных биологических субстратов интактных и подвергнутых острому стрессорному воздействию животных, изучали в опытах на интактных собаках при внутриаортальном и внутрикоронарном ее введении, а также на изолированных перфузируемых полосках миокарда лягушки и папиллярных мышцах желудочка белых крыс.

П р и м е р 1. Нативную фракцию низкомолекулярных веществ в объеме 10 мл медленно вводили через катетер в восходящую часть аорты интактных собак, наркотизированных внутривенно смесью хлоралозы (50 мг/кг) и уретана (500 мг/кг массы). В качестве контрольного раствора в том же объеме вводили 0,14 М раствор хлорида натрия рН 7,2-7,4. Оценку сократительной способности миокарда и нарушений сердечной деятельности проводили методом фазового анализа сердечного цикла (см.Кубышкин В.Ф. кардиологические фазовые синдромы. -К.: Здоровье, 1982. -191 с.).

На фиг. 1 представлены данные фазового анализа сердечной деятельности интактных собак после внутриорального введения изучаемой нативной фракции низкомолекулярных веществ. На 5-10 мин после ее введения выявлены нарушения сердечной деятельности, характеризующиеся развитием синдрома нагрузки объемом, а на 15-20 мин - синдрома высокого диастолитического давления, возникающие при изменении гидродинамического режима работы сердца и его компенсаторной гиперфункции.

Исходные данные представлены сплошной круговой линией. На радиальных осях нанесены выявленные отклонения изучаемых показателей с учетом знака (увеличение "+", уменьшение "-"). Слева дана градуировка графика для фазовых величин (с), справа - для относительных показателей (%). Фазовые величины: фаза изометрического сокращения (Ic), период напряжения (Т), период изгнания (Е), механическая систола (Sm), электромеханическая или общая систола (So). Относительные показатели: внутрифазовый показатель (ВФП), индекс напряжения миокарда (ИНМ), внутрисистолический показатель механической систолы (СП).

П р и м е р 2. Собакам, наркотизированным нембуталом, со вскрытой грудной клеткой и управляемым дыханием пункцией непосредственно в огибающую ветвь левой коронарной артерии вводили 1 мл нативной изучаемой фракции низкомолекулярных веществ. В качестве контрольного раствора в таком же количестве вводили 0,14 М раствор хлорида натрия рН 7,2-7,4.

На фиг. 2 представлены данные по изучению изменений кардио- и гемодинамики у собак после внутрикоронарного введения изучаемой фракции низкомолекулярных веществ. Выявленные изменения регистрируемых показателей указывают на развитие сердечной недостаточности, связанной с нарушением сократительной функции миокарда: снижение системного артериального давления на 15%, давления в полости левого желудочка на 19,5%, индексов сократимости миокарда (скорости нарастания давления в полости левого желудочка и индекса его расслабления), увеличение длительности систолы на 14,2% и укорочение длительности диастолы на 8,4% . Выявлено перераспределение общего коронарного кровотока: увеличение его диастолической фракции на 20,9% и снижение систолической на 23,3%.

Обозначения на фиг. 2 сверху вниз: системное артериальное давление (систолическое ---- и диастолическое - - -); давление в левом желудочке; скорость нарастания давления в левом желудочке (------) и показатель расслабления левого желудочка (- - -); частота сердечных сокращений; длительность систолы (-----) и диастолы (- - -); коронарный кровоток (систолическая фракция ------, диастолическая фракция - - -, общий -.-.-.).

На фиг. 3, 4 представлены данные по изучению влияния фракции низкомолекулярных веществ на механическую активность изолированных полосок миокарда лягушки в феномене лестницы Боудича и папиллярных мышц желудочка крыс при парной стимуляции, перфузируемых соответственно раствором Рингера или Тироде рН 7,2-7,4 после насыщения газовой смесью карбоген (96,0% О₂ и 4,0% СО₂). Механическую активность изолированных полосок миокарда лягушки и папиллярных мышц желудочка крыс определяли с помощью механического преобразователя 6МХ1С в условиях, приближенных к изометрическим. Скорость перфузии 1 мл/мин. Нативную фракцию низкомолекулярных веществ использовали в разведении 1 : 25 в соответствующем растворе для перфузии.

На фиг. 3 даны следующие обозначения: А - механическая активность полосок в нормальном растворе Рингера (а), через 3 и 9 мин после аппликации препарата фракции (б и в, соответственно), через 15 и 60 мин отмывки полосок нормальным раствором Рингера (г, д); Б - изменение относительного прироста амплитуды изометрических сокращений изолированных полосок миокарда лягушки при аппликации препарата фракции: 1 - 1-го и 2 - 15-го в ритмическом ряду.

На фиг. 4 даны следующие обозначения: амплитуда сокращения 1, скорость нарастания сокращения 2, скорость нарастания расслабления 3 и тонус 4 папиллярных мышц желудочка сердца крыс при парной стимуляции. Сплошная линия - изменение регистрируемых показателей для первого, пунктирная - для второго сокращения при парной стимуляции. Стрелка вниз - начало перфузии препаратом фракции, стрелка вверх - начало отмывки препаратов папиллярных мышц нормальным раствором Тироде.

Как следует из данных, приведенных на фиг. 3, замена раствора Рингера тестирующим раствором, содержащим изучаемую фракцию, приводит к прогрессирующему во времени снижению прироста амплитуды сокращений полосок миокарда лягушки. Последующая замена тестирующего раствора, содержащего изучаемую низкомолекулярную фракцию, на нормальный раствор Рингера не приводила к восстановлению относительного прироста амплитуды сокращений полосок миокарда к исходным величинам в течение первых 20-30 мин перфузии. Наоборот, в первые 9-15 мин перфузии нормальным раствором Рингера наблюдалось дальнейшее снижение ее прироста. Восстановление прироста амплитуды сокращений полосок миокарда лягушки в среднем до 70% по отношению к исходной величине наблюдалось лишь к 45-60 мин перфузии нормальным раствором Рингера.

При изучении влияния низкомолекулярной фракции не сократительную функцию папиллярных мышц желудочка крыс с использованием парной стимуляции (фиг. 4) установлено резкое снижение амплитуды как первого, так и второго сокращений, достигающее минимальных значений на 4 мин перфузии тестирующим раствором, свидетельствующее о существенном уменьшении силы сокращения папиллярных мышц. При этом выявлялись идентичные по времени развития, степени выраженности и направленности изменения со стороны скорости нарастания сокращения и скорости нарастания расслабления папиллярных мышц. Начиная с 5 мин опыта, отмечалась тенденция к восстановлению как амплитуды сокращения, так и скорости нарастания сокращения и последующего расслабления папиллярных мышц, однако указанные показатели не достигали исходных величин и оставались сниженными на 15-25% до конца опыта. Максимальное нарушение сократительной функции папиллярных мышц сочеталось с повышением их тонуса, а последующая тенденция к улучшению их функции сопровождалась снижением их тонической активности. Замена тестирующего раствора, содержащего изучаемую фракцию, нормальным раствором Тироде не приводила к восстановлению относительного прироста амплитуды первого и второго сокращений, а также скорости нарастания сокращения и скорости расслабления папиллярных мышц в течение последующих 10 мин перфузии. Более того, с удлинением времени отмывки нормальным раствором Тироде выявлялась тенденция к углублению вызванных нарушений сократительной функции папиллярных мышц. Увеличение их тонического напряжения приобретало стойкий характер, свойственный для развития контрактуры.

При сопоставлении с известными факторами, используемыми в качестве средств, оказывающих угнетающее действие на миокард, предлагаемое средство обладает следующими преимуществами:
- использование предлагаемой фракции низкомолекулярных веществ позволяет расширить арсенал средств эндогенного происхождения, оказывающих угнетающее действие на миокард, а также источников их выделения (миокард, печень, лимфоидные органы);
- фракция низкомолекулярных веществ, охарактеризованная в описании, обладает четко выраженным прямым угнетающим действием на миокард интактных животных, что доказано в опытах in vivo и in vitro.

- биологическое действие данной фракции низкомолекулярных веществ на сердечную мышцу реализуется через универсальный биофизический механизм, поскольку сохраняется у теплокровных и холоднокровных животных;
- установленные физико-химические свойства и характеристики фракции низкомолекулярных веществ, обладающей угнетающим действием на миокард, позволяет утверждать, что данное средство не описано в научной и патентной литературе, указанные свойства позволяют проводить достоверную идентификацию фракции в пределах каждой гель-хроматограммы;
- распределение количественного содержания фракции низкомолекулярных веществ, обладающей угнетающим действием на миокард, между изученными источниками ее выделения у интактных животных и животных, подвергнутых острому стрессорному воздействию, установление ее избирательного накопления при остром стрессорном воздействии в миокарде, а также данные по биологическому действию, направленному на угнетение сердечной деятельности, значительно дополняют и расширяют представление о молекулярных механизмах формирования сердечной недостаточности при острых стрессорных повреждениях миокарда.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии, и касается вещества, обладающего угнетающим действием на миокард. Целью изобретения является расширение сырьевой базы. Сущность изобретения: вещество, обладающее угнетающим действием на миокард, выделенное из крови, миокарда, печени, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, представляющее трипептид с мол. м. 300 дальтон с максимумами поглощения при 236 и 292 нм, содержащее гистидин, тирозин, триптофан. 4 ил., 1 табл.

ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ УГНЕТАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА МИОКАРД, выделенное из крови, миокарда, печени, тимуса, селезенки, лимфотических узлов животных, представляющее трипептид с мол.м. 300 дальтон с максимумами поглощения при 236 - 292 нм, содержащее гистидин, тирозин, триптофан.