ПЕНТАПЕПТИД И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИНГИБИТОР ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1994 года по МПК C07K7/06 

Изобретение относится к новому пентапептиду формулы
pAad-Glv-Asp-Ser-Gly-OH
где pAad - ацильная группа пиро-альфа-амино-адипиновой кислоты, обладающему специфическим ингибирующим воздействием на пропиферацию эпидермальной клетки, к его солям, фармацевтическим составам на его основе и способу получения пентапептида и фармацевтических составов.

Известно, что причина большинства кожных заболеваний (псориаз, злокачественные и доброкачественные опухоли) заключается в неравномерно увеличивающемся разрастании эпидермальных клеток. Хотя имеется несколько цитостатических лекарственных средств, их общим признаком и недостатком является то, что они токсичны и не являются специфичными для клеток органа или ткани, в которых происходит неравномерное разрастание.

Существование эндогенных веществ, специфично ингибирующих пролиферацию клеток, предполагалось в начале 1960-х годов, когда были проведены испытания с целью найти причину того, как органы взрослых людей и животных могут сохранять свой постоянный размер. Соединения, обеспечивающие равновесие между ингибированием и пролиферацией клеток, были названы "челонами" А-4762-67/539 КУ (Вiol. Rev., , 307 (1962)).

Челоны производятся в клетках тканей, следовательно, они проявляют паракринально свое воздействие с помощью так называемого механизма отрицательной обратной связи. С тех пор были выделены эти вещества из различных тканей (кожа мыши, мозговое вещество крысы, лейкоциты человека, печень мыши, кишечник мыши). Проведенные на них испытания, подтверждают гипотезу на базе челонов: ингибирующий эффект этих соединений на пролиферацию клеток является строго специфичным и обратимым.

Сегодня химическая структура многочисленных ингибиторов типа челона известна. Все эти вещества являются пептидами.

Структура эпидермального ингибитора - пентапептида (ЭИ) была открыта в середине 1980-х годов (cell. Biol. In. Pep. , 379 (1984); Biological Regulation of Cell Proliferation, Eds. R. Baserga et al., Raven Press, New-York, 1986, vol. 34, page 259). Аминокислотная последовательность этого пептида следующая
Glp-Glv-Asp-Ser-Gly-OH
Как природные, так и синтетические пептиды ингибируют пролиферацию эпидермальных клеток мышей даже в очень малой дозе (10^-14-10^-11мол/животное). Ин витро скорость пролиферации эпидермальных клеток мыши снижается примерно на 40% при введении в дозе 10^-12-10^-8 мол/л. Очевидно, что это соединение потенциально может представлять собой лекарственное средство для специфичного лечения кожных заболеваний, вызванных пролиферацией эпидермальных клеток и опухолей иной эпидермальной природы.

Данные о взаимосвязи структуры и активности, имеющиеся на настоящий момент, показывают, что активность в значительной степени связана со структурой ЭИ.

Было найдено, что замещение N-терминальной пироглутамовой кислоты (Сlp) пептида пиро-альфа-аминоадипиновой кислотой (pAad) не влияло на его ингибирующую активность пролиферации клеток. Замена Glp на pAad в биологически активных пептидах не является беспрецедентной. Обычно это замещение приводит к сохранению биологической активности или в некоторых случаях к повышению активности (германская заявка на патент N 2.414.381, венгерский патент N 180.926 и германский патент N 3. 226.242; Life Sci., , 257, 1984).

Однако даже более значительное преимущество пептидов-аналогов, полученных таким образом, заключается в том, что они менее чувствительны к ферментам, разрушающим пептиды, вследствие чего их эффект является более длительным.

Известно, что главный путь метаболизма и инактивации пироглутамиловых пептидов заключается в отщеплении пироглутамиловой части с помощью пироглутамил-аминопептидазного фермента. Пептиды, содержащие N-терминальную пиро-альфа-аминоадипиновую кислоту, являются стойкими к этому ферменту. Разница в силе и длительности активности, т.е. ингибирование пролиферации эпидермальных, но злокачественных (так называемых HeLa) клеток, с помощью пиро-альфа-аминоадипилового аналога данного изобретения по сравнению с известным пептидом является неожиданной и предпочтительной с практических точек зрения.

Ингибирующий эффект соединения по настоящему изобретению на пролиферацию опухолевых клеток является увеличенным вдвое по сравнению с природным пептидом, этот эффект поддерживается даже после 13 ч. Учитывая то, что пролиферация здоровых эпидермальных клеток ингибируется обоими пептидами в одинаковой степени, ингибирующий эффект данного пептида является значительно более селективным, чем ингибирующий эффект известного. Увеличения селективности не происходит при существующем уровне знаний в данной области техники.

Новый пептид формулы pAad-Glv-Asp-Ser-Gly-OH может быть получен любым способом, обычно применяемым в химии пептидов. Для синтеза пептида предпочтительно использовали шаговый принцип и сочетание защитной группы типа бензил/третбутил. Последнее означает, что альфа-аминогруппы временно защищаются защитными группами бензильного типа, которые могут быть селективно удалены гидрогенолизом, в то время как постоянная защита других функциональных групп обеспечивается защитными группами типа требутила, которые отщепляются в конце синтеза в ходе одной стадии с помощью ацидолиза. Согласно предпочтительному варианту осуществления данного процесса сложный глицин-третбутиловый эфир конденсируется с помощью N-бензилоксикарбонил-О-третбутил-L-серина до защищенного дипептида формулы Z-Ser(⁺Bv)-Gly-(O^tBv) в присутствии дициклогексилкарбодиимида, откуда аминозащитная группа удаляется каталитической гидрогенизацией.

Полученный свободный сложный дипептидный эфир ацилируется сложным N-бензилоксикарбонил-L-аспарагинил-альфа-(1-гидрокси-сукцинимидил)- бета-(третбутил)-эфиром для получения защищенного трипептида Z-Asp(O^tBv)-Ser/(^tBv)-Gly-O^tBv.

Бензилоксикарбонильная защитная группа вновь удаляется гидрогенолизом, высвобожденную аминогруппу ацилируют альфа-(1-гидрокси-сукцинимидил)-гамма-(третбутил)-эфиром N-бензил-оксикарбонил-L-глутамовой кислоты.

Защищенный тетрапептид формулы Z-Glv(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv подвергается каталитической гидрогенизации, а полученный в результате свободный сложный эфир тетрапептида ацилируется сложным пентафторфениловым эфиром L-пиро-альфа-аминоадипиновой кислоты. Из защищенного пентапептида третбутиловые группы удаляются в одну стадию обработкой трифторуксусной кислотой, таким образом получают новое соединение формулы pAad-Glv-Аsp-Ser-Gly-OH, которое очищают перекристаллизацией в водной спиртовой среде. Полученное таким образом соединение пригодно для фармацевтического применения.

В ходе испытания ин витро ингибирующего эффекта пролиферации клеток нового соединения использовали нормальные клеточные линии - диплоида Чанга- и опухолевые клеточные линии - эпидермальные Hela-S. Для проверки специфичности этого воздействия были также проведены испытания с использованием неприцельных клеточных линий мозгового вещества крысы и тимуса крысы.

Воздействие на пролиферацию клеток испытывалось путем измерения включения меченого тимидина.

Токсичность ин витро нового соединения изучалась испытанием на выделение Cr.

Клеточные культуры выращивали следующим образом.

Монослойные культуры нормальных диплоидных эпидермальных клеток
Суспензию эпидермальных клеток, содержащих 2×10⁵ кл./мл, культивировали в среде Паркера с добавкой 10% плодной сыворотки теленка. Элементы, слипшиеся спустя 24 ч предварительного инкубирования, обрабатывали активным ингредиентом, а затем культивировали еще 4 ч, обрабатывали 0,12% трипсином, затем приводили к окончательному виду.

Клеточные культуры Не-а-3
Cуспензию анеуплоидных опухолевых клеток, содержащую от 5×10⁴ до 2,5×10⁵ кл. /мл, взятых в процессе эндометрии, культивировали в среде Паркера ТС-199 (продукт ОК1) с добавлением 10% плодной сыворотки теленка в пробирках Bellaco. Обработку проводили после 24-часовой предварительной инкубации, 4 ч спустя клетки подвергали обработке трипсином и доводили до окончательного вида.

Кратковременное культивирование клеток мозгового вещества крысы
После обезглавливания мозговое вещество из бедренной кости удаляли у двухнедельных крыс весом 40 г, затем его суспендировали в среде Паркера ТС-199 (продукт ОК1) с добавлением 10% плодной сыворотки теленка. Пробы, взятые из суспензии, содержащие 3×10⁶ цитобластных кл./мл, инкубировали с испытуемыми веществами и без них в пробирках для сбора крови при 37^оС в атмосфере, насыщенной паром, содержащей 5 об.% двуокиси углерода, в течение 4 ч в инкубаторе А 5060 ЕК фирмы Неrаеvs.

Культура клеток тимуса крысы
Клетки тимуса крысы удаляли у самцов крыс весов 40 г после обезглавливания. Суспензию 5×10⁶ кл./мл культивировали в течение 4 ч в пробирках для сбора крови, затем доводили до конечного вида.

Испытание на выделение Сr
6×10⁷ цитобластных клеток мозгового вещества, подлежащих мечению, центрифугировали (1000 об./мин в течение 7 мин), затем клетки переводили в суспензию в 1 мл среды Паркера ТС-199 (продукт ОК1) и инкубировали с источником излучения ⁵¹Сr с активностью 3,7×10⁷ Вq (1 мкюри) при 37^оС в течение 1 ч, затем меченые клетки промывали 60 мл среды. Когда оценка была выполнена, суспензию клеток центрифугировали после обработки олигопептидом и измеряли радиоактивность всплывшего вещества.

Окончательная обработка культур
В течение 3-го и 12-го часов инкубирования добавляли 36 кВq/мл насыщенного тритием тимидина ³Н-Тоr (продукт vWVR), с удельной активностью 721 МВq/мл; 60 мин спустя пипетированием переносили аликвотные пробы 2х100 мкл на диски фильтровальной бумаги ЗММ (Whatman), а бумажные диски последовательно промывали охлаждаемым льдом 5%-ым раствором хлорной кислоты, этанолом и диэтиловым эфиром в течение 5-6 мин соответственно затем сушили.

Радиоактивность бумажных дисков замеряли в смеси, содержащей 5 г/мл 2,5-лифенилоксазола и 0,3 г/л 1,4-бис[2-(5-фенил)-оксазолил]-бензола, в жидкостном сцинтилляционном спектрометре типа Раскаrd-Tri Card. Считали число импульсов в минуту (имп./мин).

В табл. 1 показано последнее число, стандартная ошибка ( СО) и процент изменения числа импульсов по сравнению с контрольным образом.

Когда оценка испытания выделения ⁵¹Сr проведена, суспензию клеток обрабатывали олигопептидом и центрифугировали, затем определяли активность всплывшего вещества с помощью аппарата Раскаrd.

Результаты, относящиеся к воздействию соединения согласно изобретению на пролиферацию клеток, сведены в нижеследующих таблицах. Соединение согласно изобретению обозначено pAad-EI, в то время как эпидермальный ингибитор, выделенный из мыши, используемый для сравнения, обозначен EI.

Результаты, сведенные в указанных таблицах, ясно подтверждают, что pAad-EI эффективно ингибирует пролиферацию эпидермальных клеток-мишеней (табл. 1 и 2). Величина ингибирования опухолевых клеток HeLa и большая длительность воздействия значительны.

Специфичность эффекта проверяется тем фактом, что ингибирующая активность не оказывается на клетки, не являющиеся мишенями - мозговое вещество, тимус (табл.3).

Опыты по выделению ⁵¹Сr подтверждают, что pAad-EI нетоксичен, так как он не вызывает более значительной эмиссии изотопов, чем контроль (табл.4).

Дальнейшие детали процесса согласно изобретению иллюстрируются нижеследующим примером.

Нижеприведенные сокращения следующие:
Z-бензилоксикарбонильная группа;
Вос-третбутоксикарбонильная группа;
pAad-пиро-альфа-аминодипиновая кислота.

Все из аминокислот имеют конфигурацию L, если не указано иное.

Температуры плавления измеряли с помощью аппарата Тоттоли (изделие Bvchi).

Вращение плоскости поляризации света определяли поляметром типа Перкин-Элмер.

Тонкослойные хроматограммы получали на силикагелевых пластинках с предварительно нанесенным покрытием (Мегск; толщина слоя 0,25 мм).

Для эллюирования использовали нижеследующие смеси растворителей (соотношения выражены в объеме):
1) этилацетат - пиридин:уксусная кислота:вода (20:6:11)=99:1;
2) этилацетат - пиридин:уксусная кислота:вода (20:6:11)=9:1;
3) этилаацетат - пиридин:уксусная кислота:вода (20:6:11)=4:1;
4) этилацетат:н-бутанол:уксусная кислота:вода=1:1:1:1.

Для визуализации тонкослойных хроматограмм использовали нингидрин или хлоротолидин/иодид калия.

Растворы выпаривали в вакууме в вакуумном испарителе Rotavapor "R" (Bvchi) при температуре ниже 50^оС.

П р и м е р 1. pAao-Glv-Asp-Ser-Gly-OH
Ser(^tBv)-Gly-O^tB-оксалат
2,52 г (15 ммоль) Н-Gly-O^tBv. HCl и 4,43 г (15 ммоль) -Ser(^tBv)-OH растворяют в 30 мл дихлорметана, затем к раствору добавляют 2,1 мл (15 ммоль) триэтиламина.

Раствор охлаждают до 0^оС и при перемешивании добавляют 3,1 г (15 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь оставляют на ночь в холодильнике, затем осадок отфильтровывают и фильтрат выпаривают.

Маслянистый Z-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv, который получается в виде остатка после выпаривания, и 1,9 г (15 ммоль) дигидрата щавелевой кислоты растворяют в 200 мл этанола и через раствор пропускают в виде пузырьков газообразный водород в присутствии 1 г катализатора - 10% палладия на древесном угле. Час спустя катализатор отфильтровывают. Фильтрат выпаривают, кристаллический остаток смешивают с простым эфиром и отфильтровывают. Таким образом получают 4,52 г (83%) хроматографически чистого Ser(^tBv)-Gly-O^tBv-оксилата.

Температура плавления: 152-154^оС. R_f³:0,21.

Z-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-OtBv
4,37 г (12 ммоль) Н-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv-оксалата растворяют в 30 мл дихлорметана, затем добавляют 3,26 мл (24 ммоль) триэтиламина и 5,46 г (13 ммоль) Z-Asp(O^tBv)-Osv. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре всю ночь, затем выпаривают.

Выпаренный остаток растворяют в 100 мл этилацетата, затем последовательно встряхивают с использованием 30 мл раствора 1 н.соляной кислоты, 3×30 мл раствора 1 н. гидрокарбоната натрия и 30 мл воды. Раствор этилацетата сушат на безводном сульфате натрия, выпаривают и остаток после выпаривания кристаллизуют добавлением н-гексана.

Таким образом, получают 6,1 г (88%) Z-Asp(O^tBv)-Ser(B)-Gly-O^tBv.

Таким образом, получают 6,1 г (88%) Z-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv.

Температура плавления: (86)....92^oC.

R_f¹:0,68.

( )_D²⁵:-8,9^o(c=1, метанол)
H-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv-оксалат
2,81 г (4,85 ммоль) Z-Asp(O^tBV)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv и 0,63 г (5 ммоль) дигидрата щавелевой кислоты растворяют в 50 мл метанола. В растворе суспендируют 0,4 г катализатора - 10%-й палладий на древесном угле и пропускают сквозь суспензию пузырьки газообразного водорода при перемешивании в течение 1 ч.

Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают и остаток после выпаривания кристаллизуют добавлением 20 мл диизопропилового эфира. После отфильтрования получают 2,46 г сырого продукта, который отфильтровывают после смешивания с 20 мл этилацетата.

Таким образом получают 2,2 г (85%) Н-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-O^tBv.

Температура плавления: 140-142^oC.

R_f²: 0,30
( )_D²⁵: +7,35^o (c=1, метанол)
Z-Gly-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv
1,95 г (3,65 ммоль) Н-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv-оксалата встряхивают в 30 мл простого эфира и 10 мл 20%-го раствора гидрокарбоната калия. Эфирный раствор промывают в 10 мл воды, сушат на безводном сульфате натрия и выпаривают.

Полученные 1,65 г масла в виде остатка после выпаривания и 1,65 г (3,8 ммоль) Z-Gly-(O^tBv)-Osv растворяют в 20 мл дихлорметана и раствор оставляют стоять на всю ночь. После этого раствор выпаривают, остаток после выпаривания растворяют в 50 мл простого эфира и эфирный раствор последовательно встряхивают с 20 мл раствора 1 н. соляной кислоты, 2×20 мл раствора 1 н. гидрокарбоната натрия и 20 мл воды, сушат на безводном сульфате натрия и выпаривают. Кристаллический остаток смешивают с простым эфиром и оставляют стоять на ночь в холодильнике.

На другой день кристаллы отфильтровывают, в результате получают 2,06 г (74% ) тетрапептида формулы Z-Gly-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv, который является хроматографически чистым белым веществом.

Температура плавления: 124-126^oC
R_f¹: 0,68
( )_D²⁵: -21,0^o (c=1, метанол)
H-Gly-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-
Gly-O^tBv-оксалат
1,53 г (2 ммоль) Z-Glv-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv и 0,26 г (2 ммоль) дигидрата щавелевой кислоты растворяют в 40 мл метанола, затем в растворе суспендируют 0,3 г катализатора - палладий на древесном угле. После этого в раствор подают газообразный водород с перемешиванием в течение 1 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат выпаривают, остаток после выпаривания кристаллизуют добавлением н-гексана, затем отфильтровывают.

Таким образом, получают 1,30 г (90%) оксалата тетрапептида формулы H-Glv-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv.

Температура плавления: 146-148^oC
R_f²: 0,24
R_f³: 0,40
( )_D²⁵: -2,8^o (c=1, метанол)
pAad-Gly-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-
Ser(^tBv)-Gly-O^tBv
1,08 г (1,5 ммоль) Н-Glv-(O^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv-оксалата суcпендируют в 15 мл простого эфира и суспензию встряхивают с 10 мл 20%-го раствора гидрокарбоната калия до получения гомогенного раствора.

Эфирный раствор промывают с помощью 10 мл воды, сушат на безводном сульфате натрия и выпаривают.

0,97 маслянистого остатка после выпаривания и 0,5 г (1,62 ммоль) pAad-Opfp растворяют в 10 мл дихлорметана, раствор разбавляют с 10 мл дихлорметана после отстаивания в течение 1 ч, затем последовательно встряхивают с 3×10 мл раствора 1 н. гидрокарбоната натрия и 2×10 мл воды. Раствор дихлорметана сушат на безводном сульфате натрия и выпаривают, остаток после выпаривания кристаллизуют добавлением 10 мл простого эфира и оставляют стоять на ночь в холодильнике.

На другой день осадок отфильтровывают, в результате получают 0,88 г (78% ) хроматографически чистого pAad-Glv-(^tBv)-Asp(O^tBv)-Ser(^tBv)Gly-O^tBv. Температура плавления: 184-185^oC
R_f²: -0,45
( )_D²⁵: -21,0^o (c=1, метанола)
pAad-Glv-Asp-Ser-Gly-OH
0,80 г (1,06 ммоль) pAad-Glv-(O^tBv)-Asp(O^tBv-Ser(^tBv)-Gly-O^tBv растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты. После отстаивания в течение 3 ч раствор разбавляют 50 мл простого эфира, осадок отфильтровывают и тщательно промывают простым эфиром.

Полученные 0,6 г сырого продукта растворяют в 20 мл воды, осветляют добавлением древесного угля и выпаривают водоосветленный раствор. Полученный таким образом густой водный раствор разбавляют добавлением 10 мл этанола, осадок отфильтровывают и промывают этанолом.

Таким образом получают 0,27 (48%) целевого продукта, который является хроматографически чистым, белым, аморфным веществом.

R_f⁴: 0,31
( )_D²⁵: -47,2^o (c=1, метанол)
Аминокислотный анализ:
Aad=0,97 (1); GL-=1,00 (1); Asp=1,00 (1); Ser=0,81 (1); Gly=1,17 (1)
П р и м е р 2. Ампула с порошком для инъекций.

500 мг пентапептида формулы pAad-Glv-Asp-Ser Glv-OH и 9,5 г лактозы растворяют в 80 мл дистиллированной воды, пригодной для приготовления инъекций, к раствору добавляют 0,1 г метил-пара-гидрокси-бензоата, затем объем раствора дополняют дистиллированной водой качества, пригодного для приготовления инъекций, до 100 мл.

Гомогенный раствор фильтруют до стерильного, каждые 1 мл заполняют в закрываемые ампулы, а ампулы закрываются полимерной пробкой.

В результате получают ампулы с порошком, содержащие 5 мг активного ингредиента.

Если должны быть приготовлены ампулы с порошком, содержащие различное количество активного ингредиента, количество лактозы предпочтительно выбирают для дополнения веса активного ингредиента до примерно 10 г в расчете на 100 мл раствора. Вместо лактозы можно также использовать такое же количество маннита.

При введении лекарственного средства порошок растворяют в водном растворе хлористого натрия для получения изотонического раствора.

Использование: медицина. Сущность изобретения: предложен новый пентапептид формулы p Aad - Gly - Asp - Ser - Gly - OH, где pAad ацильная группа пиро-альфа-аминоадипиновой кислоты, обладающий специфическим ингибирующим воздействием на пролиферацию эпидермальных клеток, а также его соли, фармацевтические составы, содержащие его. Возможна обработка млекопитающих для ингибирования пролиферации эпидермальных клеток путем введения нового пентапептида. Изобретение охватывает способ получения как пентапептида, так и фармацевтического состава. 4 табл.

1. Пентапептид p Aad - Glu - Asp - Ser - Gly - OH, где p Aad - ацильная группа пиро-альфа-аминоадипиновой кислоты и его соли - ингибитор пролиферации эпидермальных клеток. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор пролиферации эпидермальных клеток, метил-пара-гидрокси-бензоат, лактозу или маннит и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве ингибитора она содержит пентапептид формулы p Aad - Glu - Asp - Ser - Gly - OH, где p Aad - ацильная группа пиро-альфа-аминоадипиновой кислоты, или его фармацевтически приемлемую соль.