Способ получения пентапептидов или их эфиров или их амидов или их солей Советский патент 1980 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к способу получения новых пентапептидов или их солей, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине.

В пептидной химии широко известе.н способ получения пептидов путем постепенного наращивания пептидной цепи конденсацией аминокислот или пептидных фрагментов с использованием различных методов, например карбодиимидного, метода активированных эфиров и т, п. ll.

Цель изобретения - получение с помощью известных методов пептидной химии новых пентапептидов или их солей, облада ощих интересными фармакологическими свойствами.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения пентапептидов формулы I

Tyr-A-G1y-Phe-B-X-Y /

где А - D-Ala, 0-Met, D-NLeu,

В - N-Leu, изоиеи, Pro,

X - О, NH,

Y - Н, Me, Et ,

или их эфиров или их амидов, или их солей, заключающийся в том, что

норлейцин, изолейцин или пролин, или их сложноэфирные, или амидные производные конденсируют с следующими, имеющими у N-конца отщепляемые защитные группы аминокислотами и/или пептидными фрагментами с последующим снятием защитных групп и выделением целевого продукта в виде эфира, амида, соли или кислоты.

fO

В качестве предпочтительного варианта способа конденсацию проводят или карбамидным методом, или с использованием метода активированных

15 .эфиров.

В тексте использованы следующие сокращения.

Трехбуквенные сокращения аминокислот следующие:

20

Ala - аланин

G1 у - глицин

31е - изолейцин

Leu - лейцин

Met - метионин

25

.he - фенилаланил

Pro - пролин

Туг - тирозин

Nle - норлейцин-2-аминогексановая кислота.

30 Сокращение само по себе означает аминокислоту в L-конфигурации (за исключением неактивного ), в то время как в случае D-аминокислоты э будет отмечаться каждый раз, например , D-Met - О-метионин. Z - бензилоксикарбонил-карбобензокси, Вое - трет-бутилоксикарбонил, ОТСР - пентахлорфенокси, ONP - 4-нитрофенокси, Et - этил. Met - метил. Кг значения были определены при помощи тонкослойной хроматографии на силикагеле в следующих системах растворителей: Хлороформ.метанол Этилацетат-пиридин-уксусная кис240:30:6:11лота-вода Этилацетат-пиридин-уксусная кис12:20:6:11лота-вода Этилацетат-пиридин-уксу.сная кис60:20:7:11лота-вода Этилацетат-пири.дин-уксусная кис30:20:6:11лота-вода Растворы упаривают при пониженно давлении на водяной бане при 40°С. Аминокислотные анализы пептидов про водят при помощи анализатора типа T1C-5AN, после полного гидрол/иза (6N НС1, 24 ч, ). Пример 1. Получение L-тиро зил-0-аланин-глицИл-1-фенилаланил-L-норлейцина. А. Метиловый эфир бензилоксикарб нил-2-фенилалани-п-1,-норлейцина. 1 хэаствору / г (10 М1Долей) Z-Phe OTCP и 2 г (11 тлолеи Н-N 1 е-ОМе НС 1 в 10 мл пиридина доба ляют 1,2 (11 ммолей) N-метилморфоли и смесь оставляют на 3 ч. Реакционную смесь упаривают, остаток раство ряют в 50 мл этилацетата и воды (1: органическую фазу отделяют и промывают 1 н.соляной кислоты и водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остатокпромывают эфиром, фил руют, промывают эфиром и сушат. Выход 3,6 г (85%),т.пл. 123-124 RP 0,89-0,93. Б. Метиловый эфир бензилоксикарбонил глицил-1-фенилаланил-1-норлейцина. 5,55 г (13 ммолей) Z-Phe-Nle-OMe (пример IA) растворяют в 100 мл метанола и гидрируют в присутствии па ладиевого катализатора. В конце реакции (к| 0,23-0,25) катализатор отфильтровывдют, раствор упаривают и остаток растворяют в 25 мл пириди на. После добавления 4,66 г (12 ммо лей) Z-Cly-OTCP смесь оставляют на 3 ч. Реакционную смесь упаривают. остаток растворяют в эфире, фильтруют, проглывают эфиром и сушат. Выход 5,28 г (91%), т.пл. 110112C,R 0,30-0,90. В. Метиловый эфир бензилоксикарбонил-1-тирозил-D-аланил-глицин-L-фенилаланил-1-иорлейцина. 1,92 г (4 ммолей) Z-C.ly-Phe Nle- OMe. (пример 1Б) растворяют в 30 мл метаноле и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции (R 0,10-0,20) катализатор отфильтровывают, раствор упаривают и остаток растворяют в 8 мл пиридина. После добавления 1,6 г (4 ммолей) Z-D-Ala-OTCP смеоь оставляют на 3 ч. Реакционную массу упаривают, остаток растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром и сушат. Полученный продукт ( , 67-0,70) растворяют в 50 мл смеси метанол--вода-диметилформамид (1:1:1) и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции (Rr 0,24-0,29) катализатор фильтруют, раствор упаривают и остаток растворяют в В мл пиридина. После добавление 1,75 г (3,5 ммолей) Z-Tyr-OTCP смесь оставляют на 5 ч, упаривают, остаток растворяют в 30 мл этилацетата, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток растворяют в смеси эфира и Н-гептана (1:1), фильтруют, промывают водой, смесью (1:1) и cyDjaT. Выход 2,0 г 180%) , т.пл. 195°С (сморщивается при 190°С), R 0,73О 78. Г. L-Тироэил-О-аланил-глицин-L-фенилаланил-1-норлейцин. 1,15 г X1,6 ммолей) Z-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Nle-OMe (пример 1в) суспендируют в смеси 4 мл метанола и 2 мл ацетона, омыляют 0,5 н. гидроокисью натрия в присутствии тимолфталеина в качестве индикатора. Когда поглощение щелочи замедляется, смесь разбавляют 10 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 х5 мл). Этилацетатный слой отделяют, упаривают, получают 0,3 г (26%) защищенного эфира пентапептида. Водную фазу подкисляют .0,5 н. серной кислсхгой, продукт, выпавишй в осадок (Rj. 0,250,35), суспендируют в 50 мл 80%-ной уксусной .кислоты и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В процессе реакции продукт растворяется . Катализатор отфильтровывают, раствор упаривают и остаток растворяют в 4 мл холодной воды. Полученное кристаллическое вещество фильтруют, промывают холодной водой и сушат. Выход 0,47 г (70%), R| 0,19-0,23. Аминокислотный анализ: Gly 1,0; Ala 1.,02; Nle 1,02; Туг 0,98, Phe 1 (для сравнения). Пример 2. Получение гидрох рида метилового эфира 1-тирозил-0-аланил-глицил-1-фенилаланил-1-норлейцина. 0,36 г (0,5 ммолей) Д-Ту r-D-Al a-G 1 y-PJie-OMe (пример ID) суспендируют в 30 мл уксусной кислоты и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В ко це реакции катализатор отфильтровывают, раствор упаривают и остаток растворяют в 1 мл 1 н. метанольной соляной кислоты и затем разбавляют эФиоом. Выпавший в осадок продукт фильтруют, промывают эфиром и сушат сушат. Выход 0,3 г (93%) конечного гидр хлорида пентапептидного эфира; R| 0,55-0,60. Пример 3. Получение L-тиро 3ил-О-метиоНИЛ-глицин-L-фенилаланил -L-норлейцина. 1,8 г 0,7 /lмoл8й) Z-G1y-Phe-N1е-ОМе (пример 1Б) растворяют в 30 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции (Rr 0,100,20) катализатор фильтруют и раствор упаривают. Остаток растворяют в 4 мл пиридина. Затем добавляют 1,56 г (3,65 №молей) Вое-D-Met-ОТСР и раствор оставляют на 5 ч. Реакционную смесь упаривают, остаток раст воряют со смесью эфира и н-гептана (1:1) , фильтруют, промывают указанной смесью и сушат. Полученный таки образом продукт (R 0,70-0,75) оста ляют стоять в течение 30 мин с 5 лл 2 н. соляной кислоты в этилацетате, затем разбавлякзт И-гептаном, остато отфильтровывают, промывают н-гептаном, сушат в вакууме в присутствии гидроокиси калия. Полученный продук (1,5 г; ,17-0,27) суспендируют в смеси 2 мл пиридина и 2 мл димети формамида. После добавления 1,6 г (3 ммолей) Вос-Туг-ОТСР и 0,7 г (6 дмoлeй) N-метилморфолина смесь взбалтывают до тех пор, пока добав|Ленные вещества не растворятся, и затем оставляют стоять в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и разбавляют 30 мл этилацетата и 30 мл 0,5 н. серной кислоты. Органическую фазу отделяют, промывают 0,5 н. серной кислото и водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток растворяют в 5 мл ацетона и промывают 1 н. гидроокисью натрия в присутствии тимолфталеина в качестве индикатора. В конце реакции раствор подкисляют 0,5 н. серной кислотой и взбалтывают с этилацетатом. Этилацетатную фазу упаривают и затем добавляют к остатку 10 мл 2н. соляной кислоты в этилацетате и смесь перемешивают. Через 30 мин полученную суспензию разбавляют 10 мл воды и водную фазу нейтрализуют М-метилморфолином. При охлахедении в лпавшио в осадок кристаллы отфильтровывают, промьтвают холодной водой и сушат. Выход 1,13 г (60%) пентапептида, Rf 0,3-0,4. Аминокислотныр анализ: Gly 1,0; Met 0,98; Nle 1 .0 ; Туг 0,96; Phe 1 для сравнения). Пример 4.-Получение L-тирозил-0-аланил-глицил-1-фенилаланил-1-изолеПцина. А. Глицил-1-фенилаланил-1-изолейцин. 1,95 г (7 ммолей) H-Phe-31e-OH суспендируют в 10 мл пиридина, затем добавляют 0,98 г (7 мгтолей) триэтиламина и 2,72 г (7 ммолей) Z-Gly-OTCP. Смесь перемешивают до полного растворения, добавленные вещества оставляют стоять на ночь. Реакционну1р смесь упаривают, остаток растворяют в 50 мл этилацетата и добавляют 0,5 н. серную кислоту до рН водной фазы 2-3. Органическую фазу отделяют, промывают водой, затем N-бензилоксикарбонилпептид экстрагируют 5%-ным раствором кислого карбоната натрия (3 20 ш) , объединенные экстракты подкисляют 0,5 н. серной кислотой, выпавший в осадок пептид экстрагируют этилацетатом и раствор этилацетата упаривают. Остаток (R 0,5-0,6) растворяют в 60 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают, промывают уксусной кислотой, фильтрат соединяют с промывной жидкостью и упаривают. Остаток, растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром и сушат в вакууме в присутствии гидроокиси калия. Выход 1,87 г (80%) трипептида; RJ 0,35-0,45. Б. D-Аланил-глицил-L-фенилаланил-L-изолейцин. 1,68 г (5 ммолей) H-Gly-Phe-Jle-OH (пример 4Б) суспендируют в 5 мл пиридина, затем добавляют 0,7 мл (5 лмoлeй) триэтиламина и 2,02 г (5 ммолей) Z-D-A1а-ОТСР , перемешивают до полного растворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают так же, как описано в примере 4А. Полученный остаток после упаривания (R 0,500,55) растворяют в 50 мл 80%-ной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровыва от и промывают уксусной кислотой. Растворы уксусной кислоты объединяют, упаривают, обрабатывают эфиром, фильтруют, прО1 /1Ывают эфиром и сушат в вакууме в присутствии гидроокиси калия. Выход 1,7 г (84%) тетрапептида, Rr 0,10-0,15. В. 1-Тирозил-0-аланил-глицил-1-фенилаланил-L-изолейцин.

К суспензии 1,22 г (3 ммоля) H-0-A)a-Gly-Phe-J1е-ОН (пример 4Б) в пиридине добавляют 0,42 мл(3 ммоля) триэтиламина и 1,48 г (3 ммоля) Z-Tyr-OTCP, перемешивают до полного растворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают аналогично примеру 4А. Полученный при упаривании остаток (R 0,55-0,60) растворяют в 50 мл 80%-ной уксусной кислоты и гидрируют Е присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают и промывают уксусной кислотой. Растворы уксусной кислоты объединяют, упаривают, растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром и сушат в вакууме в присутствиигидроокиси калия

Выход 1,4 г (80%) указанного в названии пентапептида, ,08-0,12. Аминокислотный анализ: Gly . 1,0; Ala 1,0; Nle 1,02, Туг 0,95, Phe 1 (для сравнения).

Пример 5. Получение L-тирозил-0-аланил-глицил-1-фенилаланил-L-пролина.

А. Глицил-L-фенилаланил-L-пролин,

К суспензий 5,25 г (20 ммОлей) H-Phe-Pro-OH в 20 мл пиридина добавляют 2,8 мл (20 ммолей) триэтиламина и 7,77 г (20 ммолей) Z-G1у-ОТСР, перемешивают до полного ражтворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают аналогично примеру 4А. Продукт, полученный при упаривании в виде осад;R J 0,5-0,6) , растворяют

в 100 мл

к а

метанола, гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. По окончании реакции катализатор отфильтровывают, промывают метанолом,, затем метанольные растворы объединяют и упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира, фильтруют, промывают эфи. ром ,и сушат.

Выход 5,43 г (85%) указанного трипептида; Rj 0,31-0,38.

Б. D-Аланил-ГЛИЦИЛ-L-фенилаланил-L-пролин..

3,2 г (10 ммолей) H-G1y-Phe-Pro-O (пример 5А) суспендируют в 10 мл пиридина, затем добавляют 1,4 мл (10 ммолей) триэтиламина и 4,03 г (10 ммолей) Z-D-Ala-OTCP и перемешивают до полного растворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают, аналогично примеру 4А. Полученный при упаривании остаток (Rj 0,42-0,53) растворяют -В 80 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции катализатор отфильтровывают, прогнивают метанолом, затем метанольные растворы объединяют и упаривают. Остаток растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром и сушат.

Выход 3,2 г (82%) указанного в названии тетрапептида; R 0,07-0,11

В. Бензилоксикарбонил-1-тирозил-D-аланил-ГЛИЦИЛ-L-фенилаланил-L-пррлин.

3,12 г (8 ммолей)

H-D-Ala-Gly-Phe-OH (пример 5Б) суспендируют в 15 мл пиридина, добавляют 1,12 МП (8 ммолей) триэтиламина и 3,95 г (8 ммолей) Z-Tyr-OTCP и перемешивают до полного растворения добавленных веществ, оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают аналогично примеру 4А. Продукт, полученный в виде остатка при упаривании, растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром и сушат.

Выход 4,4 г (80%) указанного в (Названии защищенного пентапептида, R 0,3-0,4.

Г. 1-Тирозил-D-аланил-ГЛИЦИЛ-L-фенилаланил-L-пролин.

Раствор г (3 моля) Z-Tyr-D-Ala-Cly-Phe-OH(пример 5В) в смеси 40 мл метанола и 10 мл диметил формамида гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции катализатор отфильтровывают, промывают смесью метанолаи диметилформамида 1:1, слитые вместе растворы упаривают, остаток растворяют в эфире, фильтруют, промывают эфиром, сушат, вновь растворяют в 4 мл этанола и осаждают этйлацетатом.

Выход 1,16 г (70%) указанного в названии пентапептида; R 0,3-0,4,

Аг/шнокислотный анализ: Pro 1,02 Gly 1,0; Ala 0,98; Туг . 1,0; Phe 1 (для сравнения). О П ри мер б. Получение L-тирозил-D-аланил-ГЛИЦИЛ-L-фенилаланил-L-пролин-этиламида.

О,7 г (1 ммоль)

Z-Tyr-D-A1a-G1y-Phe-Pro-OH (пример 5В) растворяют в 2 мл диметилформамида, затем добавляют 0,1 г (1,24 /IMoлей) этиламиногидрохлорида, 0,17 мл (1,24 ммолей) триэтиламина и 0,21 г (1 мглоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь оставляют на день, фильтруют, и разбавляют 30 мл этилацетата. Раствор промывают 0,5 н. сеной кислотой, водой, 5%-ным раствором кислого карбоната натрия и водой затем сушат- и упаривают. После упаривания остаток (R| 0,80-0,85) растворяют в 30 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции катализатор отфильтровывают, раствор упаривают, остатокрастирают с эфиром, фильтруют, промывают эфиром и сушат.

Выход 0,43 г (0,75%) указанного в названии пентапептида; R 0,34-0,44;

И р и м е р 7. Получение L-тирозил-0-метионил-ГЛИЦИЛ-L-фенилаланил-L-пралин-гидрохлорида.

0,96 г (3 ммоля) H-G)y-Phe-Pro-OH (пример ЗА) суспендируют в 5 мл пиридина, затем добавляют 0,42 мл (2 ммоля).триэтиламина и 1,27 мл (3 ммоля) Boc-D-Met-OTCP, перемешивают до полного растворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают аналогично примеру 4А. Затем 10 мл 2. и. соляной кислоты в этилацетате выливают, на вещество, полученное в результате упаривания (R 0,30-0,35 и смесь перемешивают. Через 30 мин реакционную смесь разбавляют н-гептаном/ фильтруют, промывают н-гептаном и сушат в вакууме в присутствии гидроокиси калия. Полученный таким образом продукт (к| 0,16-0,24) суспендируют в 5 мл пиридина, затем добавляют 0,84 мл (б ммолей) триэтиламина и 1,32 г (2,5 ммолей) Вос-Туг-ОРСТ , перемешивают до полного растворения добавленных веществ и оставляют на ночь. Реакционную смесь обрабатывают аналогично примеру 4Л. После упаривания осадок растворяют в 10 мл 2н. соляной кислоты, этилацетате, фильтруют, промывают этилацетатом и сушат. Выход 1,14 г (70%) гидрохлорида пентапептида; Rj О,35-0,45, Аминокислотный анализ: Pro 0,98 Г Met 0,95; Туг 1,0; Phe 1 (для сравнения). Пример 8. Получение L-тирозил-0-норлейцил-глицил-1-фенилаланил-1-пролин-гидрохлорида. Используя 0,96 г (3 ммоля) H-G1y-Phe-Pro-OH (пример 5А) в качестче исходного продукта, следуют методике, описанной в примере 7, с той разницей, что вместо 1,27 г Boc-Met-OTCP применяют 1,06 г (3 ммо ля) BOC-D-N1e-ONP. Выход 1,18 г(75%) гидрохлорида пентапептида; R 0,35-0,45, Аминоки лотный анализ: Pro 1,0; Gly 1,0 Nle 1 ,05; Туг 0,98; Phe 1 (для сравнения). Пример 9, Получение L-тиро зил-0-метионил-глицил-1-фенилаланил -L-пролин-этиламида, А. Гл15Цил-1-фенилаланил-1-пролин -этиламид-оксалат, 3,7 г (13 ммолей) Pro-NH-Et раст воряют в 50 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализа тора. В конце реакции (,2-0,3) катализатор отфильтровывают, промывают метанолом, метанольные раствор . упаривают и остаток растворяют в 10 мл диметилформамида, После добав ления 3,9 г (13 ммолей) Z-Phe-OH 1,75 г (13 ммолей) 1-оксибензтриазо ла и 2,7 г (13 ммолей) дициклогекри карбодиимида реакционную смесь оставляют на ночь и затем упаривают. Остаток растворяют в 50 мл этилацетата и затем промывают 5%-ным раств ром кислого карбоната натрия, водой 0,5 н. серной кислотой и вновь водо Органическую фазу сушат над сульфат натрия д. упаривают. Полученный продукт (R 0,63-0,68) растворяют в 50 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают и метанольный раствор упаривают. Остаток (R 0,1-0,2) растворяют в 10 мл пиридина, затем добавляют 2,0.9 г (10 ммолей) Z-Gly-OTCP. Реакционную смесь оставляют на ночь, затем упаривают. Остаток после упаривания растворяют в 50 мл этилацетата, промывают 0,5 н, серной кислотой и органическую фазу сушат над сульфатом натрия и упаривают, Остаток растворяют в 50 мл метанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора. В конце реакции катализатор отфильтровывают и раствор упаривают. Остаток после упаривания растворяют в смеси 2 мл этанола и 2 мл этилацетата, затем добавляют 0,9 г (10 ммолей) щавелевой кислоты и смесь разбавляют 50 мл этилацетата. Выпавший в осадок продукт фильтруют, промывают этилацетатом и сушат. Выход 2,7 г (62%) трипептидэтиламидоксалата; т.пл. 98-100°С; я| 0,4-0,5, Б. L-Тирозил-D-метионил-глицил-L-фенилаланил-L-пролин-этиламид, 0,9 г (2 ммоля) трипептид этиламидоксалата (пример 9А) растворяют в 3 мл пиридина, затем добавляют 0,86 г (2 ммоля) Boc-0-Met-OTCP и 0,56 г (4 ммоля) триэтиламина. Реакционную смесь оставляют на ночь, упаривают, остаток растворяют в 30 мл этилацетата, промывают 0,5 н, серной КИСЛОТОЙ, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток (R.| 0,800,85) оставляют с 10 мл 3 н, серной кислоты в этилацетате, после 30 мин разбавляют 30 мл н-гептана, полученный осадок фильтруют, промывают Н-гептаном и сушат в вакууме в присутствии гидроокиси калия. Полученный продукт растворяют в пиридине (5 мл) и добавляют 1,06 г (2 ммоля) Вос-Туг-ОТСР и 0,56 мл (4 ммоля) триэтиламина. Реакционную смесь оставшяют на ночь, затем упаривают, растворяют в 50 мл этилацетата, промывают 0,5 н, серной кислотой, сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток (R 0,85-0,90) растворяют в 3 мл трифторуксусной кислоты и оставляют на 30 мин. Раствор упаривают и остаток растирают со смесью этилацетата и бензола (1:1), Полученный продукт растворяют в смеси 5 мл 10%-ного раствора карбоната натрия и 50 мл этилацетата.. Водную фазу встряхивают с этилацетатом (3 10 мл), объеди-ненные этилацетатные фазы сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток после упаривания растирают со смесью н-гептана и этилацетата (1:1), осадок фильтруют, промывают этой же смесью, затем н-гептаном и сушат.