Способ получения пептидов в виде кислотно-аддитивных солей Советский патент 1986 года по МПК C07K5/11 A61K38/07 

сн Изобретение относится к способу получения новых пептидов общей формулыX-Arg-Lys-V в виде кислотно-аддитивных солей, где X - водород, Glp; V-Asp, Asp-Val, Asp-Val-NII,,, AspVal-OMe, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-lie, Ala-Val, Gly-Val, Asu-Val, обладающих иммуномодулирующей активностью, которые могут найти применение в э кспериментальной биологии и медицине Цель изобретения - способ получения новых пептидов, обладающих более широким спектром иммунорегулирующего действия. Принятые сокращения: Z - бензилоксикарбонил-; Вое - трет-бутилоксикарбонилил-; трет-бутилокси-; Opfp - пентафторфенокси-; Asu - ами носукцинил-; ОМе - метокси-; OBzl бензилокси-; ONE - 4-:щтробензилокси-группа; ДМФА - диметилформамид; ТЭА - триэтиламин. Температуру плавления определяют с помощью прибора Тоттоли фирмы Biichi (Швейцария). Гомогенность-промежуточных и конечных соединений ко тролируют с помощью тонкослойной хр матографии на пластинках с силикаге лем фирмы Merck (ФРГ) в системах: 1- этштацетат-(пиридин-уксусная кислота - вода, 20:6:11), 95:5; 2- этнлацетат - (пирндин-уксусная кислота- вода, 20:6:11), 9:1; 3- этштацетат - (пиридин-уксусная кислота - вода, 20,5:11), 4:1; 4- этилацетат - (пиридин-уксусная кислота - вода, 20:6:11), 3:2; 5- н-бутанол - (пиридин-уксусная кислота - вода, 20:6:11),, 3:7; 6- хлороформ - метанол, 9:1; 7- н-бутанол - уксусная кислота - вода, 1:1:1; 8- н-бутанол - уксусная кислота - вода, 4: 1:5. . Хроматограммы проявляли нингидри ном после хлорирования с К-толидином. Удельное оптическое вршцение измеряли на цифровом фотоэлектричес ком поляриметре Perkin-Elmer 141 (США). Растворители отгоняли на роторном испарителе фирмы (Швейцария) на водяной бане с температурой не выше . Пример 1 (Метод А). Z-Arg (N02)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Val-ONB (1). К раствору 1,73 г (6,0 ммоль) Val32ONB НС1 в 15 м,ч ДМФА добавляют 0,84 мл (6,0 ммоль) триэтш амина и 2,45 г (5,0 ммоль) Boc-Asp-OPfp. Реакционную сме.сь перемешивают 30 мин гфи комнатной температуре, упаривают, остаток растворяют в 30 мл этилацетата. Растирр промывают 15 мл и. соляной кислоты, 15 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия и 15 мл воды, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Полученный защищенный дипептид (,0,9) растворяют в 10 мл 8 и. НС в диоксане, через 15 мин добавляют 40 мл безводного эфира и упаривают досуха. Полученный в остатке свободный дипептид (Rг 0,5) растворяют в 10 мл ДМФА, доводят значение рН раствора с помощью триэтиламина до 8,0 и добавляют 3,1 г (5,5 ммоль) Boc-Lys/Z/- OPfр. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, поддерживая рН 8,0 с помощью триэтиламина, разбавляют 60 мл хлороформа и промывают 15 мл 1 н. соляной кислоты и 15 мл воды., сушат безводным сульфатом натрия и упаривают, остаток упаривают с безводным эфиром. Полученньм защищенный трипептид (Rj 0,4) высаждают со 100 мл безводного эфира,отфильтровывают,, дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0, а затем 3,3 г (7,0 ммоль) ./N02/ OPfp. Реакционную смесь перемешивают 30 мин, поддерживают рН 8,0 с помощью триэтиламина, упаривают, остаток растирают с 50 мл этанола, отфильтровывают 5 промьшают этанолом (2 к 10 мл). В итоге получают 3,85 г (,73%) 1 с т.пл. 135-148С; RjO,80. Пример 2 (.метод В). Z-Arg (N02)-Lys(,Z)-Asp(OBzI)-OBzI (II). Смесь 15,62 г (3,3 ммоль) Boc-Lys ,Z)-OPfp, 1,40 г (4,0 ммоль) Asp i;OBzI)-OBzI. HCl и 0,98 мл (7,0 ммоль) триэтиламина в 1C мл этилацетата оставляют стоять в течение часа при комнатной температуре и затем разбавляется с 20 мл этилацетата. Смесь встряхивают сначала с 10 мл 1 н, раствора соляной кислоты, затем с 10 МЛ 5%-НОГО раствора бикарбоната натрия, сушат над, безводным сульфатом натрия и затем упаривают в вакууме. Остаток укрепляют с н-гексаном, отфильтровьшают и промьюают с н-гексаном. Получаемый защищенный дипептид (выход: 81,2%; т.пл. 92-95°С; R. 0,75) обрабатывают с 30 мл 4 н солянокислого диоксаиа в течение 30 мин, затем упаривают до сухого о татка. Свободный дипептид (Rj. 0,10 растворяют в 10 мл диметилформамида раствор нейтрализуют с 0,35 мл триэтилямина и полученную суспензию добавляют к приготовленному следующим образом смешанному ангидриду: 10,6 (3,0 ммоль) Z-Arg(NO,, )-ОН и 0,42 мл (3,0 ммоль) триэтиламина растворяют в 5 мл диметилформамид. Раствор охлаждают до -10 с и при этой температуре смешивают с 0,36 мл (3,0 ммоль пивалоилхлорида капельным образом. К полученному таким путем раствору сме шанного ангидрида через 5 мин при -10 С добавляют раствор свободного пептида. Реакционную смесь перемешивают еще в течение 30 мин при ОС, затем оставляют стоять на ночь и на следующий день испаряют до сухого ос татка. Остаток растворяют в 50 мл хлороформа и раствор встряхивают с 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты, затем с 10 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия и, наконец, с 10 мл воды. После сушки органическая фаза упаривается до сухого остатка и полу ченный остаток укрепляют приготовленной в соотношении 1:1 смесью эфира и н-гексана. Получают 1,82 г (выход 84%) защищенного трипептида с R 0,70. Пример 3 (метод С). Z-Arg (N02)-Lys(Z)-Asu Val-OH (III). 2,51 г (12 ммоль) Val-OtBuHCl растворяют в 50 мл хлороформа. Раствор смешивают с 3,86 г (10 ммоль) Boc-Asp(OtBu)-OSu и 1,68 мл (12 ммол триэтиламина. На следующий- день раст вор встряхивают сначала с ЗЮ мл 1 н. раствора соляной кислоты, затем с мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия. После осушки растворитель отгоняют. Полученный в качестве остатка защищенный дипептид (R г 0,80) растворяется в 30 мл 5 н уксусной кислоты, содержащей бромистый водород, и раствор оставляют сто ять на неделю. Затем реакционную смесь упаривают до сухого остатка и остаток укрепляют безводным эфиром. Получаются 2,65 г (98,2%) Asu-Val-OH Hbr (R 0,15) и ацилируют дальше описанным в примере 1 методом. Данные защищенного тетрапептида содержатся в табл. 5. Пример 4. Arg-Lys-Asp-Val . АсОН (IV). 2,25 г (2,22 ммоль) Z-Arg(NOp Lys(Z)-Asp(OBzI)-VaI-ONB (пример 1) суспендируют в 50 мл 90%-ной уксусной кислоты. Суспензия смешивается с 1 г 5%-ного палладия на активном угле и через смесь в течение 14 ч пропускают водород. Затем катализатор отфильтровьшают, промьюают с 2«10 мл 90%-ной уксусной кислоты, фильтрат объединяют с промьшной жидкостью и затемупаривают до сухого остатка. Остаток с водой и этанолом вновь упаривают, затем растворяют в 2 мл воды и смешивают с 30 мл этанола. Полученную суспензию фильтруют и осадок промьшают этанолом. Получают 0,92 г (80%) IV. -24,8° (С1; 10% АсОН); R| О, 10. Аминокислотный анализ: Lys 1,05 Cl); Arg 0,95 (1); Asp 1,04 (1); Val 0,93 (1). Пример 5. Gip-Arg-Lys-AspVal AcOH (V). 4,1 г IBoc-Lys(Z)-Asp(OBzI)-ValONB растворяют в 10 мл 8 н. НС 1 соляной кислоты в диоксане, через 15 мин добавляют 100 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, дважды промывают эфиром и растворяют в 20 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0, а затем 3,5 г Boc-Arg(NO,)POfp и 0,98 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 1 ч, упаривают, остаток растирают с 50 мл этанола, отфильтровьшают, промывают этанолом ( мл). Полученный защищенный тетрапептид (R г 0,80) растворяют в 25 мл 8 н. НС1 в диоксане, через 15 мин добавляют к раствору 70 мл безводного эфира, выпавший осадок отфильтровывают, промьшают дважды эфиром и растворяют в 30 мл ДМФА. К раствору добавляют триэтиламин до рН 8,0, а затем 2,4 г Glp-OPfp. Реакционную смесь перемеивают 1 ч, добавляют 100 мл этаноа, выпавший продукт отфильтровывают, ромьшают этанолом (2 « 20 мл). В итое получают 3,9 г Z-Glp-Arg(NOr,)-Lys (Z)-Asp(OBzl)-Val-ONB с т.пл. 166172С, R 0,80. 2,2 г Z-Glp-Arg(NO)-Lys(Z)-Asp )-Val-ONB суспендируют в 50 мл 51 90%-НС1Й уксусной KVicjioTbi, добавляют 1 г 5%-ного Pd/C и н течение 4 ч гидрируют. Затем катализатор отфильт ровывают, промывают 10 мл 90%-ной ук сусной кислоты, объединенный фильтрат упаривают, остаток растирают с 30 М.Л этанола, образовавшийся осадок отфильтровьшают, проьлшают этанолом (2 X 10 мл) и сушат. .В итоге получают 1,12 г (,93%) V. Полученный продукт очищают с номощью колоночной хроматографии на силикагеле SI-100 с использованием в качестве элюента системы: метанол вода 1:1. В итоге получают 0,74 г V -51,3° (с 0,9;. 10%-ная уксусная кислота). Аналогично получают ряд других пептидов, физико-химические характеристики которых приведены в табл. 1-2. Иммуномодулирукяцая активность опи сываемых соединений была изучена в in vitro и in vivo по извест ным методикам. I . in vitro. Изучение на активные Е-розетки проводилось с помощью модифицирован ного способа Wybran и др. с лимфоцитами частично здоровых, частично аустоиммунно больных людей (ревмато идньй артрит и системная волчанка красная). К 50 мл клеточной суспензии лимфоцитов, смотря по обстоятельствам, добавляют 100 мл разбавленного до концентрации от 10 до 10 мол/л изучаемого вещества. Смес инкубировали при 37 С на воздухе., содержащем 5% СО j в течение 60 мин и затем смешивали с 50 мл 1%-ной суспензии эритроцитов (овечьих). За тем в течение 10 мин центрифугирова ли с числом оборотов 1000 мин , Пос ле этого стеклышки ставили на модифицированную встряхивающую машину для борьбы с желчнокаменной болезнью и встряхивали в течение 30 с {частота встряхивания: 65 мин , высота подъема 8 см). С целью фиксирования розеток к каждгй трубочке д бавляли 50 мл 0,1%-ного глутарового альдегида. Через 3 мин под микроско пом насчитывались более чем три лим фоцита, связьтающие происходящие от овцы эритроциты, всего оценивались клеток. Сепарированные лимфои;иты содержали в качестве загрязнения макрофаги и полиморфноядерные клетки 1,макснма,.но 10%). Часто связывающие puvieTKH клетки корригировались в каждом случае до этого значения. Полученные результаты представлены в табл. 3-4. Тест ингибиронания азатиоприном { -розеток. Суспензию клеток, содержащую 2 10 лимфоцитон/мл, получают из крови здоровых доноров, выбранных по случайному закону. Тест на ингибирование азатиоприном Е-розеток выполняется corjiacbio ранее описанному способу. Коротко, этот способ состоит во введении в 200 мкл суспензии клеток 500 мкл азатиоприна и 200 мкл HBSS без добавок, или содержащего исследуемое вещество. Вещества подвергают испытанию при кондентрациях в пределах от 1C до 10 моль/л. В качестве сравнительного эксперимента смешивают 200 мкл суспензии клеток и 400 мкл HBSS. Полученные смеси инкубируют в воздухе, содержащем 5% двуокиси углерода, при 37°С в течение 1 ч, после чего смешивают с 200 мкл суспензии 1% SRBC и центрИ11)угируют при 90g в течение 5 мин. 400 мкл верхней фракции (жидкости) удаляют и после осторожного повторного суспендирования берут для расчета образования Е-розеток по меньшей мере 400 клеток (образование розетки - когда 3 или более SRBC окружают один лимфоцит). Статистический анализ осуществляется с использованием распределения Стьюдента. Вследствие различной активности в отношении образований Е-розеток у лимфоцитов,, полученных от различных доноров и различной их ингибируемости азатноприном, вешества характеризуются их способностью восстанавливать активность лимфоцитов к образованию Е-розеток, ингибируемую азатио прином, выраженной в % восстановления (R %): .O i5Kc;2l MClA-ERFC) ERFC - Az-ERFC где ERFC н Az-ERFC обозначают средний процент клеток, образующих Е-розетки, без ингиЕжтора и в присутствии азатиоприна соответственно. Эксп-ERFC представляет собой проUefJT клеток, образующих Е-розетки, в присутствии азатиоприна и экспериментально Io вещества. Получе ные ре: ультаты 111 дставлены в табл. 5. II. in vivo. 1 . Для изучения оказывающего влияния на продукции антител дейстиия выбирали метод Цетловского. Новорожденным Winter - крысам самое позднее в 12-й час после их рождения внутрибрюшинно вводилось подлежащее изучению вещество в форме 25 мл жидкости с концентрацией от 4-1U до 410 мол/л (единичная доза на каждые 9 животных). В возрасте 14 дней животные иммунизировались пу тем внутрибрюшинного введения каждому 0,5 мл 5%-ной суспензии эритроцитов овцы, и на 7-й день после иммунизации животные обескровливают пу тем декапитации. Кровь каждых трех животных объединяют, в течение 10 мин центрифугируют с числом оборотов 3000 мин и в таким образом полученной сьшоротке определяют титр антител по методу Така tsy. Результаты выражались как титр агглютинации, причем в качестве титра принималось то наибольшее разбавление сыворотки, при котором еще раз личимой является агглютинация. Результаты сведены в табл. 6. 2. Число клеток, производящих спе цифические антивещества, определялось по методу Ganningham. Суть метода состоит в том, что из клеток селезенки иммунизированных жи вотных, из суспензии эритроцитов овцы и комплемента готовится гомогенна суспензия и вводится в камеру пригод ную для развития моноклеточных слоев Вокруг клеток, производящих антивещества, образуется постепенный ореол и число этих ореолов (пятен) идентично с числом клеток, ирчитнодячих. ci; цифнчЕюе антивещество (Plagito forming cells, PFC). Подопытные ЖИВОТПЫР максимум па 12-й час после своего ро кдепия один раз впутрибрюшинно обрабатыБались с подлежащим изучению веществом. Со1ласпо методу () каждое вещество изучалось в трех дозах. На 7-й день после иммунизации изучалась способность пропарированных из животных селезеночных клеток к образованию Plague. В табл. 7 указано частное от числа Plagues обработанных животных и числа Plagues необработанных контрольных животных. I Как видно из данных,приведенных в табл. 3-7, соединения, получаемые предлагаемым способом, обладают щироким спектром иммуномодулирующего действия в сочетании с низкой токсичностью. Формула изобретения Способ получения пептидов общей формулы X-Arg-Lys-V где X - водород, Glp; V-Asp, Asp-Val, Asp-Val-NH , AspVal-OMe, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-lie, Ala-Val, Glu-Val, Asu-Val, в виде кислотно-аддитивных солей, о т л и чающийся тем, что синтез осуществляют путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с эфира С-концевой аминокислоты, методом активированных эфиров и методом смещанных ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных групп каталитическим гидрогенолизом. Свойства свободных пептидов

Изобретение касается пептидов, в частности их получения в виде кислотно-аддитивных солей общей формулы I X-Arg-Lys-Y, где X - Н, Сер; Y - Asp, Asp-Val, Asp-Val-NH, Asp-Val-OCHg, Asn-Val, Asp-Ala, Asp-lie, Ala-Val, Glu-Val, Asu-Val, которые обладают иммунологической активностью -и могут быть использованы в биологии и медицине. Для выявления активности среди пептидов были получены новые 1. Их синтез ведут ступенчатым наращиванием пептидной цепи, начиная с эфира С - концевой аминокислоты, методом активированных зфиров и методом смешаннЕлх ангидридов с последующим отщеплением от конечного защищенного пептида защитных g групп каталитическим гидрогенолизом. Испытания 1 показьшают, что они облаО) дают более широким спектром иммунос регулирующего действия при низкой токсичности, чем известные пептиды. 6 табл. to -ч ;о о со

с 1, в 10%-ной уксусной кислоте.

хроматографированный в колонке, заполненной силикагелем S1-100, водой и метанолом 1:1. АсОН уксусная кислота.

Связываюяая Е-розетки активность.лимфоцитов, страдающих ренлтондкьм артритом (выраженная в процентах активности лимфоцитов, п-4)

блица 3

Связывающая Е-роэетки активность лушфоцитов здоровых активности лимфоцитов, п «4

Т.авлица 4 процентах

15 16Arg-Lya-Aap-lU 33,2 30,7 15,0 17Clp-Atg-Lys-Asp-Val-Tyr 24,1 29,9 25,5

Р 0,05 г F тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на ТР5); Р 0,01 F тест (с однопараметр-изменяющимся анализом, считая на ТР5); Р 0,05 Student аначнтельвое действие.

Эффект аналогов, TP-S н леваниэола в отношении ингибнруеного азатиоприном образования Е-роэеток

EPFC

AZ-ERFC

Соединение

45,9±3,0I4,8i5,541,0t8,l yr

56,,2I6,2±l,829.4t5,6 л

, 47,4t4,312,,934,016,7

.- S4,6t|,619,,921,,0

46,Oil,311,211,022,4i6,0

57,,721,6+7,531,6i4,3

56,,313,7+2,421,713,0

54,,619,111,99,,1

58,716,619,,6-18,715,2

56,,313,,421,915,8 «l-Tyr

64,415,022,9i3,924,611,4

Действие in vivo, вьтолняющее продукцию антител, выраженное как титр агглютинации (титр антител At SD) 12,0108,,3 1Arg-Lys-Asp-Val-Tyr I0,5t|,5 2Arg-Lys-Asp-Ala6, 3Arg-Lys-Asp

16

1277903

Продолжение табл.4

-2,5; +2,3 5,8

Таблиц 5

Восстановление в О, в присутствии соедннекня в концентрации, мол/л

..:

47,,,2}3,,8l4,0 26,744,6

30,,.,4 29,,0 31,,3

32,5t6,l46,417,0 35,,6 35,,5

33,,,,,949,,,5

17,413,615,,6 23,,8 14,,1

I7,9t3,818,316,0 28,8i5,7 11,,8

23,3+6,0Ib,9i5,3 28,516,1 12,213,5

37,,,,5 18,,2 42,417.3

15,612,027,914,4 26,216,8 37,116,6

ia,,223,514,1 22,,8 30,,6

26,8t5,540,,9 38,415,8 27,,0

13,,330,014,9 25,8110,4 22,,2

17,412,422,,1 2l,ll8,3 11,813,0

30,,117,,6 22,315,8 28,817,2

I8,4i8,615,813,6 10,,8 12,814,0

29,,327,,4 40,117,8 12,816,0

Таблица 6 34,932,035,5 29,422,529,9 10,712,3 9,0.1,7 --9,311,5 11,510,9 -12,010 -9,3il,5 -7,,6. -6,011,2 5,211,3