СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-1-ИНГИБИТОРА В ПЛАЗМЕ КРОВИ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-диагностических лабораториях.

С^-I - ингибитор (СIИ), как и другие белковые ингибиторы, является регулятором процессов протеолиза. Это один из основных ингибиторов таких важных систем крови, как калликреин-кининовая и система комплемента.

Известен способ определения СIИ в плазме крови, основанный на том, что в плазму крови вносят очищенный фермент СI-эстеразу, об активности которого судят по гидролизу низкомолекулярного субстрата - п-нитрофенолового эфира N- α -карбобензокси-L-лизина. Под действием СIИ плазмы крови снижается активность внесенной в плазму СI-эстеразы. О количестве СIИ в анализируемой порции плазмы судят по уменьшению скорости гидролиза используемого субстрата. Ферментативную pеакцию проводят в термостатируемой кювете при 37^оС, отмечая в течение 3 мин изменение поглощения при 340 нм.

Главными недостатками способа являются:
Необходимость использования СI-эстеразы - высокоочищенного фермента.

Трудность выделения СI-эстеразы.

Отсутствие в коммерческой продаже специфического субстрата.

Использование спектрофотометра с термостатируемой кюветой.

Целью изобретения является упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения СIИ в плазме крови, включающем предварительное блокирование альфа-2-макроглобулина ( α₂ -М) плазмы метиламином (МА), активирование калликреина и определение аргининэстеразной активности согласно изобретению активируют эндогенный калликреин плазмы коалином, а в качестве субстрата реакции используют протаминсульфат.

Предлагаемый способ определения СIИ основан на том, что в плазме крови этот компонент является основным ингибитором активного калликреина (к/к). Другим ингибитором этого фермента является α₂ -М. Эти два ингибитора полностью контролируют активность плазменного к/к.

Использование способа МА необратимо блокировать антипротеиназное действие α₂ -М открывает возможность сведения антикалликреинового эффекта плазмы практически только к одному ингибитору, а именно - к СIИ. В свою очередь, объект воздействия СIИ - активный калликреин - может быть получен посредством активации прекалликреина (ПК) плазмы 1-минутным контактом ее с каолином.

Активность к/к до и после воздействия СIИ оценивают по количеству аргинина, образовавшегося в результате гидролиза белкового субстрата - протаминсульфата. Для расчета содержания СIИ в анализируемой плазме (после ее обработки МА) определяют общую протеолитическую активность (ОПА), а также активность калликреина через 1 мин и через 5 мин после активации этой плазмы каолином. Снижение активности между 1-й и 5-й минутой происходит за счет угнетения калликреина имеющимся в плазме СI-ингибитором.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежую цитратную плазму инкубируют 1 ч при комнатной температуре с МА в конечной концентрации 1,2%. Затем "метиламиновую" плазму делят на 2 части. В одной части (контроль) определяют исходную протаминрасщепляющую активность: к 0,1 мл плазмы добавляют 0,5 мл 0,05 М мединалового буфера (pH 7,6) и 0,2 мл 1%-ного раствора протаминсульфата. Пробы инкубируют 15 мин при 37^оС, после чего реакцию останавливают, добавляя 0,8 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Нерасщепившийся протаминсульфат осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 8000 об/мин. В прозрачном центрифугате определяют содержание аргинина методом Сакагуши в модификации Храмова. Для этого к 1 мл центрифугата добавляют при перемешивании по 1 мл энтеросептола. 2,5% NaOH и NaBrO. Светопоглощение полученной смеси (Е_к) измеряют с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56 М со светофильтром N 5 или на спектрофотометре при 508 нм.

Вторую часть "метиламиновой" плазмы (опыт) используют для определения активности калликреина до и после угнетения его С-I-ингибитором. С этой целью в полиэтиленовую пробирку вносят 0,8 мл обработанной МА плазмы и добавляют при перемешивании 0,8 мл 1%-ной суспензии каолина. Затем точно через 1 мин (срок полного превращения прекалликреина в активный калликреин) и через 5 мин (срок полного выявления угнетающего действия С-I-ингибитора) отбирают по 0,2 смеси в пробирки, содержащие по 0,4 мл 0,05 М мединалового буфера (pH 7,6) и 0,2 мл 1%-ного раствора протаминсульфата. Последующую 15-минутную инкубацию при 37^оС, остановку ферментативной реакции раствором ТХУ, центрифугирование и фотометрическое определение аргинина в центрифугате реакцией Сакагуши осуществляют так же, как это описано для анализа первой части "метиламиновой" плазмы. Светопоглощение проб, взятых через 1 мин (Е₁) и через 5 мин (Е₅) после добавления каолина, отражает соответственно полную активность калликреина, образовавшегося из прекалликреина анализируемой плазмы, и остаточную активность калликреина, регистрируемую после угнетения калликреина С-I-ингибитором, содержащимся в анализируемой пробе.

Долю угнетенного калликреина, отражающую содержание С-I-ингибитора в исследуемой плазме рассчитывают по уравнению:
A = × 100%
Пример выполнения способа:
Для определения протаминрасщепляющей активности плазмы использовали метод К.Н.Веремеенко.

1 мл цитратной плазмы (донор Красюков, 22 года) инкубировали в полиэтиленовой пробирке 1 ч при комнатной температуре с 0,2 мл мединалового буфера, содержащего 20 мг метиламина. По истечении срока инкубации по 0,1 мл плазмы помещают в 2 пробирки, содержащие 0,5 мл 0,05 М мединалового буфера (pH 7,6). В первую пробирку приливают 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата. Пробы инкубируют 15 мин при 37^оС. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,8 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу (пробирка N 2) после ТХУ добавляют 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата.

В оставшиеся 0,8 мл плазмы, обработанной МА, добавляют при перемешивании 0,8 мл 1%-ной суспензии каолина. Через 1 мин и через 5 мин отбирают по 0,2 мл смеси в пробирки, содержащие 0,4 мл 0,05 М мединалового буфера (pH 7,6). В опытные пробы добавляют 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата. Пробы инкубируют 15 мин при 37^оС. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,8 мл 20% раствора ТХУ. В контрольные пробы после ТХУ добавляют по 0,2 мл 1% раствора протаминсульфата. После осаждения нерасщепившегося протаминсульфата пробы центрифугировали 30 мин при 8000 об/мин. В прозрачном центрифугате определяли содержание аргинина: к 1 мл центрифугата добавляют 1 мл энтеросептола, встряхивают; приливают 1 мл 2,5% раствора NaOH, встряхивают; приливают 1 мл NaBrO, встряхивают. Полученные смеси фотометрируют с помощью фотоэлектороколориметра 56-М со светофильтром N 5. Определяют разность экстинкции между опытной и контрольной пробами:
Е_к=0,112 - до активации каолином
Е₁=0,392 - после 1-минутной активации каолином
Е₅=0,186 - после 5-минутной активации каолином
A = × 100% = 73,7%
В таблице суммированы данные, полученные на плазме крови доноров по предлагаемому способу.

Снижение активности калликреина в плазме крови здорового человека за счет С-I-ингибитора по предлагаемому способу составляет от 37,3 до 86,9%.

Предлагаемый способ может быть широко использован в клинико-диагностических лабораториях.

В сравнении с прототипом предлагаемый способ не требует:
использования очищенного фермента СI-эстеразы, выделение которой связано с определенными трудностями, а в коммерческой продаже данный фермент отсутствует;
применения труднодоступного специфического для СI-эстеразы субстрата;
наличия спектрофотометра с термостатируемой кюветой.

В предлагаемом способе используются широко распространенные, дешевые реактивы. СФ с термостатируемой кюветой может быть заменен обычным фотоэлектроколориметром, что приводит к значительному упрощению способа.

Способ определения C-1-ингибитора в плазме крови. Использование: медицинская биохимия, может быть использовано в клинико-диагностических лабораториях. Цель: упрощение способа. Сущность изобретения: у пациента берут пробу крови, получают плазму, предварительно блокируют α₂ плазмы метиламином, а эндогенный калликреин плазмы активируют коалином, при этом в качестве субстрата при определении аргининэстеразной активности используют протаминсульфат. 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-1-ИНГИБИТОРА В ПЛАЗМЕ КРОВИ, включающий предварительное блокирование α₂ -макроглобулина плазмы метиламином, активирование калликреина и определение аргининэстеразной активности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, активируют эндогенный калликреин плазмы каолином, а в качестве субстрата реакции используют протаминсульфат.