СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицинской биохимии, а именно к методам исследования ферментативных процессов, и может быть использовано в исследовательских и клинико-биохимических лабораториях.

Эстеразную активность протеолитических ферментов определяют потенциометрическим и спектрофотометрическим способами. Однако их низкая чувствительность привела к необходимости создания газохроматографического метода.

Известен способа определения эстеразной активности протеолитических ферментов с помощью газохроматографи- ческого парофазного анализа.

Сущность способа сводится к введению раствора субстрата в буфере в реактор (стеклянный флакон), герметизации последнего, термостатированию, перемешиванию, введению раствора фермента в буфере в инкубационную смесь, выдержке в течение определенного времени, добавления в смесь ингибитора для остановки реакции и отбору пробы равновесного газовой фазы над жидкостью во флаконе с последующим газохроматографическим анализом содержания в ней летучего продукта ферментативной реакции и установлению показателя, коррелирующего со значением эстеразной активности протеолитического фермента.

К недостаткам прототипа относятся возможные погрешности расчета активности вследствие использования только одной точки, а также наличие ошибок, связанных с вероятностью выбора временного интервала не в пределах линейного участка кинетической кривой.

Целью изобретения является повышение точности и надежности определения эстеразной активности протеолитических ферментов за счет газохроматографической регистрации значительного количества точек кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата в ходе одного опыта.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения эстеразной активности протеолитических ферментов, включающем газохроматографическую регистрацию продуктов ферментативной реакции, определяют значение фонового сигнала, а после введения фермента в процессе ферментативной реакции осуществляют непрерывную (без остановки реакции) газовую экстракцию продукта путем пропускания постоянного газа над инкубационной смесью, регистрируют прирост концентрации летучего продукта в газовой фазе во времени и определяют активность по усредненному значению этой величины.

Предлагаемый способ определения эстеразной активности протеолитических ферментов и известный сопоставлены в таблице.

Предлагаемый способ определения эстеразной активности протеолитических ферментов основан на том, что образующийся в ходе гидролиза эфирных субстратов продукт (спирт) обладает достаточной летучестью и приходит в равновесное распределение с контактирующим с жидкостью потоком инертного газа, который затем может быть многократно дозирован в хроматограф, при этом прирост высоты пика на хроматограмме при каждом таком дозировании будет (с учетом калибровочного коэффициента) соответствовать количеству превращенного субстрата за определенное время.

Способ основан на соотношении, являющемся следствием основных уравнений, описывающих непрерывную газовую экстракцию реакционных систем, и связывающем активность фермента А и наклон полученного на хроматограмме начального участка кинетической кривой (dh/dt)_о (h - высота пика на хроматограмме, t - время проведения реакции):
А = lH (dh/dt)_o, (1) где l - переводной коэффициент, позволяющий перевести начальную скорость в требуемые единицы активности фермента;
Н - градуировочный коэффициент, определяемый соотношением
Н = С_ж/h', где С_ж - концентрация определяемого вещества в растворе;
h' - высота пика определяемого вещества на хроматограмме, полученной дозированием газовой фазы над раствором в условиях, соответствующих условиям проведения измерений эстеразной активности протеолитических ферментов.

На фиг.1 изображена установка, позволяющая определять эстеразную активность протеолитических ферментов методом непрерывной газовой экстракции. Опыты проводят в стеклянном реакторе 1, впаянном в термостатирующую рубашку 2, подсоединенную к циркуляционному ультратермостату, и снабженном магнитной мешалкой 3. Реактор имеет отверстие 4 для ввода пробы, закрывающееся герметизирующей резиновой мембраной 5. Газовый поток по линии А подается в реактор через входной патрубок 6, проходит над слоем жидкости 7 и затем по выходному патрубку 8 поступает в дозирующую петлю 9 (объем петли 0,5 мл) шестиходового газового крана-дозатора 10 хроматографа "Цвет-102" 11 и далее в мыльно-пленочный измеритель расхода газа 12 (положение крана I). Газ-носитель по линии Б при этом поступает в аналитическую колонку 13 и затем в детектор. В положении крана-дозатора 11 газ по линии Б захватывает содержимое дозирующей петли и направляет в хроматограф на анализ. Хроматограф должен быть предварительно откалиброван по растворам с известным содержанием летучего продукта в среде, соответствующей среде протекания реакции. Практически калибровочный коэффициент можно определять, например, проведением непрерывной газовой экстракции смеси с известным содержанием летучего вещества.

Способ осуществляют следующим образом.

В реактор 1 помещают раствор субстрата в буфере, затем реактор герметизируют и для установления теплового равновесия жидкость перемешивают в течение 5-10 мин, при этом одновременно проводят несколько отборов проб газовой фазы для регистрации фонового сигнала. Затем через мембрану 5 из силиконовой резины микрошприцем (или с помощью дозатора через отверстие 4 при открытой мембране) вводят раствор фермента в буфере. Отбор газовой пробы для регистрации количества превращенного субстрата в определенный момент времени производится поворотом газового крана 10 в положение II. После записи хроматограммы для данного ввода проводят повторное дозирование (предварительно переведя кран в положение I) и так далее в течение всего опыта. По окончании реакции строят зависимость высоты пика летучего продукта на хроматограмме от времени, затем при помощи метода наименьших квадратов рассчитывают наклон кинетической кривой на начальном линейном участке, умножением на калибровочный коэффициент (уравнение (1)) определяют начальную скорость ферментативной реакции и затем переводят в требуемые единицы активности фермента.

Способ применим для определения активности таких ферментов, как трипсин, α-химотрипсин, C1s-субкомпонент комплемента, плазмин и т.п. с использованием субстратов N-бензоил-L-аргинин этилового эфира, N-бензоил-L-аргинин метилового эфира, N-ацетил-L-тирозин этилового эфира, N-бензоил-L-тирозин метилового эфира, N-ацетил-L-лизин метилового эфира, N-тозил-L-аргинин метилового эфира и др. Кроме того, возможно определение активности и других протеаз при наличии соответствующих субстратов (пепсина, каллекреинов, протеаз системы свертывания крови и комплемента, амино- и карбокси-пептидаз).

П р и м е р 1. В реактор, термостатируемый при 37^оС, помещали 4,5 мл фосфатного буфера (рН = 6,86) и 0,5 мл буферного раствора а-N-бензоил-L-аргинин-этилового эфира ("Реанал", Венгрия) концентрации 1,44 ммоль/л; скорость газа, пропускаемого через реактор, составляла 11 мл/мин. Смесь термостатировали 10 мин. Затем прокалыванием резиновой мембраны микрошприцем "Hamilton 701N" в смесь вводили 5 мкл раствора трипсина ("Спофа", ЧСФР) концентрации 0,575 мг/мл. Первое переключение газового крана проводили через 1 мин после дозирования, затем дозирование выполняли каждые 2 мин. На фиг.2 приведена зависимость измеренной высоты пика этанола на хроматограмме h от времени t для двух параллельных опытов. Начальный наклон кривой, вычисленный по четырем первым точкам, составил 3,845 мм/мин. Умножением на калибровочный коэффициент для этанола на данной чувствительности хроматографа (0.00227 ммоль/л ˙ мм) получаем начальную скорость реакции 8,174 мкмоль/л ˙ мин, что соответствует удельной активности (на 1 мг чистого фермента) 14.2 Е (где 1Е - количество фермента, вызывающее превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин).

П р и м е р 2. В реактор, термостатируемый при 37^оС, помещали 0,5 мл раствора а-N-бензоил-L-аргининэтилового эфира ("Реанал", Венгрия) концентрации 0,887 ммоль/л; скорость газа, пропускаемого через реактор, составляла 13 мл/мин. Смесь термостатировали 10 мин. Затем через отверстие при помощи дозатора для жидких проб в смесь вводили 0,5 мл раствора с 1 эстеразы (получена из плазмы крови человека по модифицированному методу) и герметизировали реактор при помощи резиновой мембраны. Первое переключение газового крана проводили через 1 мин после дозирования, затем дозирование выполняли каждые 2 мин. На фиг.3 приведена зависимость измеренной высоты пика этанола на хроматограмме h от времени t для трех параллельных опытов. Начальный наклон кривой, вычисленный по 13 первым точкам, составил 3.20 мм/мин. Используя калибровочный коэффициент для этанола на данной чувствительности хроматографа (0.00227 ммоль/л ˙ мм), получаем удельную активность фермента (на 1 мл препарата) 40.8 мЕ.

Использование предлагаемого способа позволяет получить достаточно большое число точек на кинетической кривой и уменьшить погрешности, связанные с определением активности по одной точке; повысить надежность определения линейного участка кинетической кривой; расширить диапазон определяемых скоростей реакций; в исследовательских целях проводить вычисления скорости и на нелинейных участках кривой.

Споcоб являетcя вполне доcтупным для иcпользования в клинико-биохимичеcких лабораториях и позволяет увеличить точноcть и надежноcть измерений по cравнению c прототипом.

Использование: изобретение относится к медицинской биохимии, методам исследования ферментативных процессов и может быть использовано в исследовательских и клинико-биохимических лабораториях. Целью изобретения является повышение точности и надежности определения эстеразной активности протеолических ферментов за счет газохроматографической регистрации значительного количества точек кинетической кривой ферментативного гидролиза субстрата в ходе одного опыта. Сущность: проводят определение значения фонового сигнала, а после введения фермента в процессе ферментативной реакции осуществляют непрерывную газовую экстракцию продукта путем пропускания постоянного потока газа над инкубационной смесью, регистрируют прирост концентрации летучего продукта в газовой фазе во времени и определяют активность по усредненному значению этой величины. 3 ил., 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий введение раствора субстрата в буфере в реактор, герметизацию последнего, термостатирование, перемешивание, введение раствора фермента в буфере в инкубационную смесь, установление показателя, коррелирующего со значением эстеразной активности протеолитических ферментов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и надежности, до введения раствора фермента в буфере в инкубационную смесь проводят регистрацию значения фонового сигнала, а после введения в процессе ферментативной реакции осуществляют газовую экстракцию продукта путем прокачки постоянного потока газа над инкубационной смесью, при этом в качестве показателя, коррелирующего со значением эстеразной активности протеолитических ферментов, устанавливают величину прироста концентрации летучего продукта в газовой фазе во времени, а определение эстеразной активности осуществляют по усредненному значению установленной величины.