СПОСОБ ИНГИБИЦИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Российский патент 1994 года по МПК A61K35/80 

Изобретение относится к медицине, а именно для профилактики и лечения СПИДа и СПИД-ассоциированных заболеваний.

Известен способ ингибиции ВИЧ-инфекции с помощью фукоидана.

Недостатком известного способа является то, что фукоидан обладает токсичностью.

Целью изобретения является снижение токсичности.

Данная цель достигается использованием низкомолекулярного сульфатированного полисахарида (НСП) с мол.в. около 15000 Дальтон, содержащего фукозу, сульфатированную по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями и коррелируют с уроновыми кислотами при соотношении 1:4 (SO₃-FUC; UA-COOH), при этом исходный продукт получают из водоросли ламинария японская (Laminaria japonica).

НСП имеет следующие характеристики.

Физическая характеристика полисахарида. Материал и методы.

Хроматографический анализ был произведен на стеклянной колонке с гидрофобным сорбентом Полихром-1 и с сефакрилом S-300 (Фармациа, Швеция) с использованием детектора 1КВ UV-VIS (при 254 нм с 2 мл препаративной проточной клетки). Карбогидраты определяли фенольно-сернокислым методом.

Для анализа моносахаридов использовали жидкостную газовую хроматографию на хроматографе Свет-2 со стеклянной колонкой 2,5 х 0,4 см (3% OV-225 на хроматроне N-HMDS) при 150-230^о, 5^о/мин.

Образцы для анализа готовили гидролизом полисахаридного препарата при 90^оС в течение 2 ч с 2N HCl с последующим получением перацетата альгитола обычным способом.

Спектр ядерного магнитного резонанса (Н и ¹³С ЯМР) определяли на спектрометре Bryker WM-250. Химические сдвиги регистрировали в ppm от тетраметилксилана.

Результаты.

НСП (МВ около 15000 Дальтон), белый аморфный порошок; [α]_27,8²⁵=¹³C ЯМР(Д₂₀); 102,4; 101,2; 100,7; 99,1 ppm (C-1) ¹³C ЯМР(Д₂О); альгинат: 102,4; 101,2; 100,7(С-1) 71,2; 71,8; 66,0(С-2) 72,6; 72,8; 70,5(С-3) 79,2; 801,1(С-4) 772; 682(С-5) 176,1; 175,8; 175,6(С-6) фукоидан: 99,1(С-1) 74,9(С-2) 67,9(С-3) 81,3(С-4) 67,9(С-5) 17,2; 16,6(С-6).

¹³С - ЯМР спектр определяли на спектрометре WM-250 (Bryker).

Таким образом, показано, что полисахаридная фракция является низкомолекулярным компонентом с фукозой, сульфатированной по 4-му положению и ее остатки связаны α-1,2-гликозидными связями и коррелируют с уроновыми кислотами (маннуровой и гулуроновой) в соотношении 1:4 (SO3-FUC:UA-COOH).

Биологическая характеристика полисахарида.

П р и м е р 1. Ингибирующая активность НСП против адсорбции ВИЧ-1 и цитопатического действия вируса определялась на клетках МТ4 следующим образом:
a) Прямой вируснейтрализующий эффект
1 мл суспензии ВИЧ-1, полученной после высокоскоростного центрифугирования вируссодержащей культуральной жидкости из клеток Н9/ШВ или НТН1У₂₇ и 1 мл раствора НСП в соответствующих концентрациях (0,1 до 100 мгк/мл) помещали в пробирки и оставляли для контакта на 2 ч при 37^оС или комнатной температуре. После этого равные количества клеток МТ4 предобработанных полибреном были добавлены в каждую пробирку для адсорбции вируса с множественностью инфекции (МИ), равной 100, и оставляли для контакта при 37^оС на 1-1,5 ч.

После контакта клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием в течение 10 мин, супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в среде РРМ1 1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки до конечной концентрации 2 х 10⁵ кл/мл. Клеточную суспензию в количестве 1 мл распределяли в 24-луночные плато и культивировали при 37^оС и 5% СО₂ в течение 7 дней.

б) Ингибирующий эффект НСП на адсорбцию ВИЧ-1 на клетках МТ4.

По 2х10⁵ кл/мл МТ4 распределяли в каждую лунку 24-луночных плато и после короткого периода оседания клеток на дне лунок вносили соответствующие концентрации НСП и преинкубировали при 37^оС в течение 1 ч, после чего вносили вирусную суспензию с МИ-100 и культивировали клетки при тех же условиях 7 суток. Процент клеток, экспрессировавших и неэкспрессировавших вирусный антиген на поверхностной мембране вычисляли как среднее арифметическое трех повторностей от каждых 100 клеток в методе непрямой иммунофлуоресценции.

Соотношение Х адсорбции-ингибиции вируса, зависимое от концентрации НСП определяли по следующей формуле, %:
X = 100 - , где a - антиген положительных клеток в препаратах, обработанных НСП, %;
b - антиген положительных клеток в необработанных препаратах, %
100 - антиген положительных клеток в контрольных препаратах (см. табл. 1 и 2).

Антикоагуляционный эффект НСП был более чем в 10 раз ниже, чем у гепарина. Если 50% значение для анти-ВИЧ активности на клетках МТ4 (см. табл. 1 и 2) перевести из мкг/мл в ед/мл, получим следующие значения, ед/мл: НСП 6,7х10^-3; фукоидан 3,6х10^-3; гепарин 1 х 10-3.

Таким образом, НСП обладает анти-ВИЧ активностью при концентрациях более чем в 100 раз низких, чем его антикоагуляционная активность.

Определение ин виво и ин витро острой токсичности полисахаридной фракции НСП.

Определение острой токсичности ин виво проводили на белых мышах (по 10 животных в каждой группе), 4-5 недельного возраста, массой 21-24 г. НСП, разведенный в физиологическом растворе в соответствующих концентрациях, вводили животным тремя различными путями: внутривенно, внутриперитонеально, перорально. Ведущие симптомы, гибель и массу тела исследовали у каждого животного в течение 7-дневного периода наблюдения, после чего каждое животное забивали и подвергали анатомическому исследованию внутренние органы. Как показано в табл. 3, ни у одного животного, получавшего препарат одним из указанных способов, не было обнаружено никаких симптомов острой токсичности или каких-либо нарушений морфологии внутренних органов (см. табл. 4).

Цитотоксичность НСП ин витро на клетках МТ4 и Н9 не проявлялась даже при концентрациях препарата выше 5000 мкг/мл в сравнении с прототипным фукоиданом, для которого 50% цитотоксическая доза, определяемая по выживанию клеток МТ4, равна 1060 ± 210 мкг/мл или с азидотимидином (Сигма), который токсичен для клеток при концентрациях выше 1000 мкг/мл.

Таким образом, НСП может быть использован как в виде самостоятельной формулы, так и в качестве составного компонента фармацевтической композиции или в комбинации с другими известными препаратами, такими как АЗТ.

Ингибирующий эффект НСП на обратно транскриптазную активность ин витро определяли с использованием вируса птичьего миелобластоза (АМВ) в качестве источника энзима (предоставлен НИИ молекулярной биологии и генетики АН СССР, Киев). Тестирование проводили по известному методу. 2 мг НСП растворяли в 1 мл стерильной дистиллированной воды и доводили до соответствующих концентраций. 20 мл объем реакционной смеси состоял из:
50 мМ Трис-HCl, pH 8,2; 5 μМ MgCl₂; 1 μg олиго (d АТР) РНК, рН 8,2 в качестве матрицы, 20 μ М dАТР, dСТР, dТТР и 0,5 μ Ki ³H-dСТР; 60 μМ KCl, 1 μ М β-меркаптоэтанола и помещали в 1,5 мл пробирки Эппендорф, которые помещали в водяную баню при 37^оС на 5 мин. После этого 20 мкл ранее приготовленного раствора НСП соответствующих концентраций добавляли в реакционную смесь вместе с 1 мкл обратной транскриптазы АМВ и оставляли для взаимодействия при 37^оС на 1 ч. После этого реакционную смесь переносили на мембранные фильтры ДЕ-81, промывали 5 раз с 5-минутными перерывом при встряхивании, высушивали и помещали в стеклянные контейнеры, содержащие по 10 мл жидкого сцинтилляционного коктейля. Радиоактивность (с.р.м.) каждого фильтра подсчитывали за 1 мин в сцинцилляционном счетчике. Уровень ингибиции обратно транскриптазной активности (ИТА) подсчитывали по формуле
ИТА = x 100, %, где С_о - контрольная радиоактивность образца без НСП;
C_s - радиоактивность образца после преинкубации с НСП.

Уровень ингибиции ОТ активности показан на чертеже.

Таким образом, сульфатированный полисахарид низкого мол.в. не проявляет какой-либо токсичности для клеток ин витро в дозах свыше 5000 мкг/мл и лабораторных животных ин виво и может быть получен с помощью дешевой безотходной технологии путем обработки морской водоросли (Laminaria japonica).

Использование: в медицине, а именно для профилактики и лечения СПИДА и СПИД-ассоциированных заболеваний. Сущность: в способе используют низкомолекулярный сульфатированный полисахарид с мол. в. менее 20000 Дальтон с фукозой, сульфатированной по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями, и коррелируют с уроновами кислотами при соотношении 1 : 4 (SO₃-FUC, UA=COOH) , при этом исходный продукт получают на водоросли ламинария японская. Положительный эффект: сульфатированный полисахарид низкого мол. в. не проявляет какой-либо токсичности для клеток ин витро в дозах свыше 5000 мкг/мг. 1 ил., 3 табл.

СПОСОБ ИНГИБИЦИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ путем применения сульфатированного полисахарида, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности, используют низкомолекулярный сульфатированный полисахарид с мол.м. менее 20000 Дальтон, с фукозой, сульфатированной по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями и коррелируют с уроновыми кислотыми при соотношении 1 : 4 (SO₃ - FUC; UA - COOH), при этом исходный продукт получают из водоросли Ламинария японская (Laminaria japonica).