ШТАММ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА НТНIV 27 - ПРОДУЦЕНТ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1996 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики СПИДа, скрининга противовирусных препаратов, а также для изучения патогенеза ВИЧ-инфекции.

Известен штамм продуцент ВИЧ-1 Н9/IIIB (R. Gallo, M. Popovic, US Patent N 4, 647, 773, Mar. 3, 1987).

Недостатком штамма является колеблющийся уровень экспрессии вирусного антигена (10 80 инфицированных клеток популяции могут быть антиген-позитивны от пассажа к пассажу), клеточной выживаемостью 65 85 и связанной с этим необходимостью периодического добавления в культуру свежих неинфицированных исходных клеток Н9.

Цель изобретения повышение выхода целевого продукта полноценного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) без клеточной деструкции.

Предметом изобретения является штамм культуры клеток человека НТНIV27 - продуцент вируса иммунодефицита человека.

Штамм клеток-продуцентов ВИЧ-1 НТНIV27 получен клонированием Т-лимфобластоидных человеческих клеток МТ4, инфицированных ВИЧ-1 с использованием техники лимитирующего разведения на фидерном слое.

Штамм НТНIV27 депонирован в ГКВ N 4122 от 17.ХII. 92 г. и характеризуется следующими признаками.

Морфология. Штамм НТНIV27 представлен типичными Т-лимфобластоидными морфологически однотипными клетками с центрально расположенным крупным ядром и ободком цитоплазмы, бедной органоидами. Периферия клетки покрыта большим количеством микроворсинок, кардинально отличающих этот тип клеток от всех других суспензионных Т-лимфобластоидных культур. Клетки вирус-продуцирующего штамма НТНIV27 морфологически неотличимы от их родительских клеток МТ4 неинфицированных вирусом. Они также одинаково обладают высокой способностью роста в культуре в виде крупных многоклеточных агрегатов.

Культуральные свойства. Штамм НТНIV27 непрерывно и устойчиво культивируется в суспензионной культуре в стационарных или роллерных условиях при 37^oC в атмосфере 4,7 CО₂ в среде RPMI 1640 с 10-ной фетальной коровьей сыворотки и 100 Ед/мл гентамицина, при соотношении жидкой и воздушной фаз 1:5. Штамм поддерживается путем серийных пассажей каждый 4 или 5-й день разделением пула клеток на 2, при посевной дозе 5 х 10⁵ кл/мл.

Штамм НТНIV27 сохраняется неопределенно долгое время в жидком азоте (-196^oС) в присутствии криоконсерванта диметилсульфоксида (DMSO), при концентрации 11 15 х 10⁶ клеток/мл в среде следующего состава: фетальная коровья сыворотка 90 DMSO 10 антибиотики 100 Ед/мл.

Полученный штамм может быть использован для приготовления диагностических тест-систем на СПИД, скрининга противовирусных препаратов, а также для изучения фундаментальных проблем патогенеза ВИЧ-инфекции.

Пример 1. Для контроля содержания внутриклеточного антигена ВИЧ используется непрямой метод иммунофлуоресценции (НИФ) на стеклах с фиксированными клетками НТНIV27 и окрашенными последовательно поливалентной ВИЧ-позитивной антисывороткой и антивидовым конъюгатом IgG с ФИТЦ. Результаты, представленные на фиг. 1 показывают, что 100 клеток одновременно экспрессируют антиген ВИЧ-1.

Пример 2. Ультраструктурная характеристика клеток штамма НТНIV27 и продуцируемого вируса дана по результатам электронно-микроскопического анализа ультратонких срезов (фиг. 2), где показано, что даже клетка, находящаяся на стадии деления, во время которого приостановлены все биосинтетические процессы, тем не менее продуцирует вирус.

Пример 3. Характеристика антигенных свойств вируса из штамма НТНIV27 суммирована в табл. 1.

Пример 4. Сравнительная оценка антигена из клеток НТНIV27 с антигеном из клеток Н9/IIIB приведена в табл. 2.

Таким образом, сравнительная характеристика антигена двух продуцентов ВИЧ указывает на значительные преимущества такового у штамме НТНIV27 по его количественному содержанию, инфекционности и полному представительству белков в иммуноблоте.

Приведенные выше характеристики позволяют использовать штамм НТНIV27 для высокочувствительной и высокоспецифичной диагностики СПИД, а для скрининга противовирусных препаратов и решения фундаментальных проблем патогенеза ВИЧ-инфекции. ТТТ1

Использование: вирусология, культура ткани. Сущность изобретения: штамм культуры клеток человека НТНIУ27 - продуцент вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), получен путем клонирования с использованием техники лимитирующего разведения на фидерном слое. Штамм обладает стабильными культуральными свойствами и оптимально высокой персистентной продукцией вируса (в 100 % клеток одновременно) без клеточной деструкции. Продуцируемый вирус высокоинфекционен для чувствительных клеток. Имеет полное представительство белков в иммуноблоте. Штамм может быть использован для высокочувствительной и высокоспецифичной диагностической системы на СПИД, для скрининга противовирусных препаратов, а также для решения фундаментальных вопросов патогенезов ВИЧ-инфекции. 2 табл., 2 ил.

Штамм культуры клеток человека НТНIV27 ГКВ N 4122 продуцент вируса иммунодефицита человека.