СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности, к иммунологическим методам определения антигенов.

Известен способ определения антигенов, основанный на поэтапном внесении в лунки 96-луночного планшета F (ав)₂-фрагментов поликлональных антител (ПА), исследуемого образца антигена, синтезированного конъюгата, который получают путем обработки бактериофага Ф Х174 избытком N-ацетил-DL-гомоцистеин- γ -тиолактона, 5' , 5' -дитиобис(2-нитробензойной кислотой), Fав' - фрагментов поликлональных антител, дитиотреитола (ДТТ) с последующим переносом содержимого каждой лунки на твердую питательную среду, содержащую индикаторную микробную культуру, инкубацией при 37^оС и учетом результатов визуально по зонам лизиса.

Однако данный способ обладает рядом недостатков:
- недостаточной чувствительностью для определения ряда антигенов, длительным временем синтеза конъюгата и постановки реакции, а также повышенным расходом Fав' -фрагментов антител.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа, сокращение времени синтеза конъюгата и проведения исследований.

Способ заключается в следующем: для синтеза конъюгата используют Fав' -фрагменты специфических антител. Бактериофаг ФХ174 обрабатывают N-ацетил-DL-гомоцистеин- γ -тиолактоном, а Fав' -фрагменты 5' , 5' -дитиобис (2-нитробензойной кислотой) и избытком иодацетамида. В лунки планшета для микротитрования последовательно вносят (Fав)₂-фрагменты специфических поликлональных антител, образцы исследуемых антигенов, раствор конъюгата и дитиотреитола, затем содержимое лунок одновременно переносят на твердую среду с индикаторной культурой микроорганизмов и автоматически учитывают результаты на спектрофотометре.

П р и м е р 1. Синтез конъюгата. К 50-100 мкг Fав' -фрагментов моноклональных антител к рекомбинантным γ или α₂-интерферонам в 0,1 М бикарбонате натрия, рН 8,0, с трилоном Б (0,002 М) добавляют 20 мкл 0,2 М 5' , 5' -дитиобис (2-нитробензойной кислоты) в диметилформамиде, инкубируют при комнатной температуре 30 мин и хроматографируют на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной тем же буфером. К 0,1 мл бактериофага Ф Х 174 (4х10¹¹ частиц в 1 мл) добавляют 50 мкл 0,1 М N-ацетил-DL-гомоцистеин- γ -тиолактона в 0,2 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 10,5, с 0,002 М трилоном Б, инкубируют 1 ч при 4^оС и хроматографируют на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М бикарбонатом натрия, рН 8,0, с 0,002 М трилоном Б. Обработанные таким образом Fав -фрагменты антител и бактериофаг смешивают, инкубируют при 37^оС 2 ч, охлаждают, добавляют 10 мкл 0,1 М иодацетамида и инкубируют 30 мин при 4^оС. Образовавшиеся конъюгаты хроматографируют на колонке с сефарозой 6В, уравновешенной 0,1 М трис-HCl буфером, рН 8,0, с 0,002 М трилоном Б, добавляют 50 мкл 5% -ного бычьего сывороточного альбумина и хранят при 4^оС.

П р и м е р 2. Способ определения антигенов, построение калибровочной кривой. В 96-луночный планшет вносят по 50 мкл F(ав)₂-фрагментов ПА против γ - или α₂-интерферонов, разведенных 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,4, с 0,15 М хлористого натрия до концентрации 2 мкг/мл и инкубируют в течение ночи. Содержимое лунок удаляют и добавляют 100 мкл 0,1% -ного бычьего сывороточного альбумина, разведенного в том же буфере, и после инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре трижды отмывают тем же буфером с добавлением 0,05% твин 20. В первые два ряда лунок и во вторые два ряда лунок вносят соответственно по 50 мкл стандартного γ- или α₂-интерферона в количестве от 1 МЕ до 1000 МЕ мл. После инкубации в течение 1 ч при 37^оС планшет отмывают 3 раза описанным выше раствором и добавляют в каждую лунку по 50 мкл конъюгата (1-2х10⁷/мл бляшкообразующих единиц) и инкубируют 1 ч при 37^оС. Планшет отмывают 5 раз указанным выше раствором и добавляют 50 мкл 0,01 М дитиотреитола или предпочтительно 0,01 М цистеина и инкубируют 20 мин при 37^оС.

Материал из лунок одновременно отбирают и переносят с помощью переносного устройства, имеющего 96 полых отростков, на застывший на крышке от планшета равномерный слой 0,9% -ного агара с 1,5% пептона и индикаторными микроорганизмами E. coli (10 мл расплавленного агара с пептоном и охлажденного до 50^оС и 1 мл культуры микроорганизмов, примерно 5х10⁹ клеток в 1 мл). Результаты учитывают после инкубации в течение 2,5-3 ч при 37^оС с помощью автоматического спектрофотометра. Чувствительность определения составляет 1,5-3 МЕ/мл для γ -интерферона и 1 МЕ/мл - для α₂-интерферона.

П р и м е р 3. Определение α₂-интерферона в крови человека. Добровольцу ректально вводят 10⁶ МЕ α₂-интерферона и определяют кинетику его содержания в крови биологическим методом и с помощью данного способа. Результаты исследований практически совпадают. Интерферон начинает определяться через час после введения (1800 МЕ/мл), через 2 ч достигает максимального значения (5600/мл), а примерно через 4 ч содержание интерферона снижается до 1080 МЕ/мл.

Приведенные примеры показывают, что Fав '-фрагменты антител, имеющие смешанный дисульфид на концевой тиогруппе, в противоположность использованным ранее Fав' -фрагментам, имеющим свободную тиогруппу, не теряет своей реакционной способности в результате окисления и димеризации. Это позволяет сократить время синтеза конъюгата в 5 раз и расход Fав-фрагментов минимум в 10 раз. Применение иодацетамида для блокирования оставшихся тиогрупп в конъюгате позволяет не вносить в него дополнительный заряд. Применение Fав -фрагментов моноклональных антител приводит к снижению фона (как и отсутствие дополнительного заряда) и позволяет использовать конъюгаты в больших количествах, что обуславливает увеличение чувствительности способа больше, чем на порядок (2-5 пг/мл против 300 пг/мл). Кроме того, одномоментный отбор и перенос проб сильно сокращает время осуществления способа и позволяет стандартизовать и как следствие автоматизировать учет результатов. Таким образом, предложенный способ может быть эффективно использован в биомедицинских исследованиях. (56) Бюллетень экспериментальной биологии медицины, 1988, N 12, с. 704-706.

Использование: медицинская биотехнология, в частности методы определения антигенов. Сущность изобретения: определение антигенов с помощью конъюгата бактериофага ФХ174 и Fab′-фрагментов специфических моноклональных антител, обработанных избытком иодацетамида. Результаты реакции учитывают после переноса исследуемого материала на индикаторную культуру микроорганизмов и автоматического выявления зон лизиса. Чувствительность определения составляет 1,5 - 3 МЕ для γ-интерферона и 1 МЕ/мл для a₂-интерферона.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ, предусматривающий последовательное внесение в лунки планшетов для микротитрования фрагментов специфических антител, исследуемого антигенсодержащего материала, синтезированного конъюгата бактериофага ФХ174 и фрагментов специфических антител и далее дитиотреитола с последующим переносом содержимого лунок на индикаторную микробную культуру, инкубацией при 37^oС и учетом результатов по зонам лизиса, отличающийся тем, что для синтеза конъюгата используют Fab¹-фрагменты специфических моноклональных антител, обработанных избытком иодацетамида, содержимое всех лунок одновременно переносят на индикаторную микробную культуру с помощью автоматического устройства, а результат реакции учитывают спектрофотометрически, выявляя зоны лизиса по изменению оптической плотности микробной индикаторной культуры.