ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 1994 года по МПК A61K31/21 

Изобретение относится к противовирусным средствам, применяющимся в медицине и ветеринарии.

Сущностью изобретения является применение органического соединения полипренилфосфата (ППФ) против вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-1), гепатита А (ВГА), клещевого энцефалита (ВКЭ), чумы плотоядных (ВЧП) и энтерита (ВЭ).

Известно применение ППФ и их аналогов в качестве гипотензивных и противоязвенных средств, гепатопротекторов, препаратов, восстанавливающих чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам (ЕР 0059258 В1, С 07 С 57/03; ЕР 0350801 А 2 А 61 К 31/045).

Биологические характеристики ППФ.

П р и м е р 1. Активность ППФ в отношении ВИЧ-1.

В опытах используют пермиссивную для репродукции ВИЧ-1 линию человеческих СД4 клеток МТ4 и ВИЧ-1.

Клетки выращивают в 24-луночных микропластинах в среде RРMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мкг/мл L-глютамина и 20 мкг/мл гентамицина. Инкубацию осуществляют в СО₂ инкубаторе при 37^оС, 5% СО₂ и 100% влажности.

Условия заражения: клетки суспендируют в ВИЧ-1, содержащей жидкости в концентрации 500 тыс/мл и инкубируют 2 ч. После этого в дуплицированные культуральные лунки вносят клетки с ВИЧ-1, добавляют ППФ или конъюгат ППФ с азидотимидином (ППФ-АЗТ) в концентрациях 10-500 мкг/мл. Проводят дальнейшую инкубацию 5-7 дней. В качестве эталонного препарата сравнения используют коммерческий препарат АЗТ фирмы "Серва" (ФРГ).

Тестирование проводят в трехкратных экспериментах методом непрямой иммунофлюоресценции (ингибиции ВИЧ) с использованием пула ВИЧ-позитивных сывороток от больных СПИДом и серопозитивных носителей ВИЧ-инфекции. Результаты оценивают по числу антигенпозитивных клеток (в % ) в контрольной и опытных культурах. Усредненные данные представлены в табл. 1.

Установлено, что ППФ обладает дозозависимым ингибирующим действием в отношении ВИЧ-1. В концентрации 500 мкг/мл вызывается ингибиция ВИЧ-1 на 98% .

П р и м е р 2. Активность ППФ в отношении ВГА.

Монослойную культуру FRhK-4 (среда роста: среда Игла-МЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов и с 10% эмбриональной телячьей сыворотки), заражают суспензией ВГА и инкубируют в течение 24 сут при 37^оС с эженедельной сменой среды поддержания (среда Игла-МЕМ с 1% эмбриональной телячьей сыворотки). Содержание антигена ВГА определяют в клеточных лизатах на 7-е и 24-е сутки после инфицирования твердофазным иммуноферментным методом. Инфицирование культур ВГА проводят при одновременном внесении с ППФ либо через 1 ч после внесения в культуру ППФ. Параллельно ставят контроли на репродукцию ВГА и на цитотоксичность ППФ по взятым концентрациям.

Усредненные данные опытов представлены в табл. 2.

Установлено, что ППФ в дозах 0,4 и больше мкг/мл обладает ингибирующим действием в отношении ВГА. При внесении ППФ за 1 ч до заражения подавление ВГА наблюдается через 7сут, но не сохраняется через 24 сут. Наоборот, при одновременном внесении ППФ и ВГВ в культуру ингибиция ВГА наблюдается через 24 сут.

П р и м е р 3. Активность ППФ в отношении вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Сирийских хомяков 4/5-недельного возраста (масса 80-100 г) заражают подкожно штаммом "В-383", по 0,25 мл вирусной суспензии, содержащей ВКЭ в дозе 1000LD в 1 мл.

На 6-7 сутки после заражения на фоне развившейся клинической картины заболевания животным вводят ППФ внутримышечно однократно в дозах 0,5-1,0 мг на животное. Предварительно ППФ в тех же дозах вводят незараженным животным для проверки возможного токсического действия на организм.

В результате установлено, что в контрольной группе хомяков, зараженных ВКЭ, 100% животных погибли через 7-8 сут после заражения, что соответствует нормальному течению острой инфекции. В группе хомяков, леченных ПФВ, гибель животных наступила лишь на 18-е сутки после заражения на фоне прекращения действия препарата (ежедневные инъекции ППФ при крайне тяжелом состоянии позволяли поддерживать жизнь зараженных хомячков). Токсичности у препарата ППФ не выявлено. Препарат ППФ обладает высокой терапевтической активностью при клещевом энцефалите.

П р и м е р 4. Активность ППФ в отношении вируса чумы плотоядных (ВЧП).

Исследования проводят на культуре клеток чувствительной к ВЧП линии 4647. В монослой клеток в культуральных флаконах объемом 50 мл вносят по 0,1 мл ВЧП с титром 2,4 lg БОЕ/мл, инкубируют при 34^оС в течение 2 ч (стадия адсорбции), после чего наносят агаровое покрытие. Перед внесением агара его смешивают с ППФ до разведения ППФ до конечных концентраций (20 и 200 мкг/мл). Контролем служат культуры с ППФ в тех же концентрациях (без ВЧП) для выявления цитотоксичности ППФ. Опыты повторяются двукратно.

Усредненные результаты представлены в табл. 3.

Таким образом, препарат ППФ обладает высоким, дозозависимым ингибирующим действием в отношении ВЧП. 100% -ный ингибирующий эффект наблюдается при дозе ППФ 200 мкг/мл.

П р и м е р 5. Активность ППФ в отношении вируса эктромелии.

Мышам линии Balb/c с клиническими признаками развившейся эктромелии (опухшие мордочки, заплывшие глаза, распухшие конечности, изъязвленные хвосты) вводят однократно внутримышечно или внутрибрюшинно ППФ в дозе 500 мкг/0,1 мл. Контрольной группе назначают плацебо. Наблюдение за животными проводят в течение месяца и больше.

Установлено, что в группе больных мышей, лечебных ППФ, наблюдается быстрое полное выздоровление (в среднем за 3-7 сут), тогда как в контроле 100% мышей погибает.

Таким образом, ППФ обладает высокой терапевтической активностью при эктромелии.

П р и м е р 6. Терапевтическая активность ППФ при вирусных заболеваниях домашних животных. Препарат вводят в терапевтических целях молодым поросятам, больным гастроэнтеритом, внутримышечно, в дозе 0,25 мг/кг массы тела, однократно. Контрольным животным вводят плацебо.

Установлено, что у 35 поросят (100% больных животных) после введения ППФ достигнуто полное клиническое выздоровление. В контроле ни одно животное не выздоровело.

Препарат вводят однократно или многократно (в зависимости от клинической тяжести заболевания) внутримышечно или внутривенно в дозе 0,25 мг/кг собакам, больным чумкой, гепатитом или энтеритами различной этиологии.

Установлено, что при заболеваниях средней тяжести и при тяжелых формах полное излечение достигается в 100% случаев. При крайне тяжелой степени заболевания (параличи конечностей при чумке, крайне тяжелая форма энтерита после нескольких дней развития заболевания) в отдельных случаях смертельный исход предотвратить не удается. При отсутствии лечения смертельный исход наблюдается практически в 100% случаев.

Таким образом, установлено, что препарат ППФ является высокоэффективным антивирусным средством, обладающим выраженной ингибирующей активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека, гепатита А, клещевого энцефалита, чумы плотоядных (вируса кори человека), вирусов энтеритов и гепатита собак и свиней, вируса эктромелии. При этом препарат не обладает токсичностью in vitro даже в концентрации 1 мг/кг и нетоксичен in vivo.

Все указанное позволяет сделать вывод о том, что ППФ является высокоэффективным средством для борьбы с вирусными инфекциями, в частности, вызванными вирусами иммунодефицита человека, гепатита, энтеритов, клещевого энцефалита, кори и чумы плотоядных. (56) Exp. Hematol, 1989, v. 17, N 4, p. p. 321-325.

Предложен полипренилфосфат общей формулы в качестве противовирусного средства, который проявляет свою активность in vitro в отношении вирусов иммунодефицита человека, гепатита А и in vivo в отношении клещевого энцефалита, чумы плотоядных, эстромелии, вирусном гастроэнтерите и других. Ранее полипренилфосфат и его аналоги применялись в качестве гипотензивных и противоязвенных средств, гепатопротекторов, препаратов, восстанавливающих чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам В 1, 3 табл.

Применение полипренилфосфата общей формулы

(WT_2-3C_9-17P)
в качестве противовирусного средства.