СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФАТИДИЛХОЛИНА Российский патент 1994 года по МПК A61K37/22 A61K35/66 A61K7/00 

Изобретение относится к медицине, точнее к косметологии, и может быть использовано для получения мазей и кремов.

Лецитины или фосфатидилхолины (ФХ) широко применяются в медицине, косметике и других отраслях промышленности. Однако их препараты весьма дороги и, кроме того, источником их получения служит пищевое сырье (бобы сои и яйца кур). Получение ФХ из фосфолипидных концентратов растительного или животного происхождения осуществляется фракционированием органическими растворителями. Однако, содержание ФХ в соевых бобах - основном источнике производства ФХ из растительного сырья - составляет не более 22-35,5% от общего количества фосфолипидов, в то время как его содержание в желтках куриных яиц составляет около 72%. Это требует для получения равных количеств ФХ значительно больше растительного сырья, чем куриных яиц.

Получение ФХ из cои или яичных желтков само по себе достаточно дорого. Кроме того, и соя и яйца кур представляют собой пищевое сырье.

Основной задачей изобретения является замена источника получения ФХ (пищевое сырье) на сырье непищевого происхождения.

В качестве прототипа была взята схема получения ФХ из желтков куриных яиц. На чертеже представлена эта схема получения ФХ.

Целью изобретения является сокращение числа стадий выделения ФХ и удешевление стоимости конечного продукта. Поставленная цель достигается тем, что в качестве источника получения ФХ используются липиды, получаемые из дрожжеподобного гриба Pichia membranaefaciens, штамм ВКМ-У-934 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов. г. Пущино. Институт физиологии микроорганизмов). Этот штамм при его культивировании на этаноле в стерильных условиях синтезирует до 12% липидов, которые включают в себя 48-54% фосфолипидов и в их числе - фосфатидилхолин. В зависимости от условий получения, его содержание в липидах P.membranaefaciens составляет 20-35%. Штамм ВКМ-У-934 в настоящее время используется промышленностью для получения цитохрома С, а также других веществ.

После того как эти продукты получены, оставшаяся биомасса P.membranaefaciens обычно выбрасывается. Таким образом, источник получения дрожжевого ФХ на сегодняшний день весьма дешев.

П р и м е р. Процесс культивирования дрожжеподобных грибов проводится в стерильных условиях при периодическом режиме в ферментере. Питательная среда включает в себя в качестве источника углеродного питания - этанол, а также следующие компоненты, г/л: KH₂PO₄ 3; (NH₄)₂SO₄ 1; MgSO₄ ˙ 7H₂O 1; NaCL 0,2; FeSO₄ ˙ 7H₂O 0,025; H₂SO₄ 0,3 мг/л; 5%-ный дрожжевой экстракт 50 мл/л. Минеральное питание и этанол в процессе культивирования подавали порциями по мере потребления этанола до уровня содержания биомассы. Культивирование проводили при аэрации и температуре 30 ± 2^оС и рН 4,0-4,1.

Инокулят выращивали в качалочных колбах объемом 750 мл с 10 мл среды следующего состава, г/л: Na₂HPO₄ ˙ 12H₂O 7; NH₄H₂PO₄ 10,3; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,7; KH₂PO₄ 6,8; этанол 10 мл/л. Засев колб производили культурой дрожжей, выращенных на сусло-агаре в течение суток.

ВЫДЕЛЕНИЕ ФХ. Выделение ФХ из биомассы осуществляли по схеме, включающей дезинтеграцию клеток дрожжеподобных грибов, сепарацию клеточных оболочек, осветление полученного дезинтеграта методом ультрацентрифугирования, отделение из дезинтеграта фракции циадсорбционной хроматографии липидов.

ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ БИОМАССЫ. Дезинтеграцию биомассы микроорганизмов проводили в проточном баллистическом дезинтеграторе МЛ-1 при температуре 8-10^оС с использованием полистирольных бус размером 0,25-0,5 мм. Клеточные стенки отделяли от дезинтеграта центрифугированием при 2000 g. Ультрафильтрацию проводили в две стадии:
1) Осветление полученного дезинтеграта на мембране с размером пор 100000 Дальтон;
2) Отделение цитохрома С с помощью мембран с размером пор 3000 и 1000 Дальтон.

СУШКА БИОМАССЫ. Сушка биомассы осуществлялась в распылительной сушилке типа "Ангидро". После сушки биомассу экстрагировали обезвоженным изопропанолом. Суспензию биомассы выдерживали в течение 20-24 ч, отфильтровывали и промывали на фильтре изопропанолом. Извлечение липидов из биомассы составляло 80-92% от их иcходного cодержания. Затем поcле отгонки изопропанола, экcтракт смешивали с гексаном и отфильтровывали нерастворимую в гексане фракцию, а из оставшейся фракции выделяли ФХ методом адсорбционной хроматографии.

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. На стадии адсорбционной хроматографии применяли силикагель АСКГ и систему растворителей: хлороформ-хлороформ; этанол-хлороформ; этанол-вода. Выход ФХ из белково-жирового дезинтеграта составлял 15-20 г на 1 кг биомассы. Разработанный метод получения ФХ позволяет получить целевой продукт с содержанием основного вещества, равного 90-96%. В качестве примесей в ней содержатся следы пептидов, индекс окисленности составляет 0,32.

Выделение лецитина из биомассы P.membranaefaciens осуществляется по схеме, включающей дезинтеграцию клеток дрожжеподобных грибов, сепарацию клеточных оболочек, осветление полученного дезинтеграта с помощью ультрафильтрации, отделение от дезинтеграта фракции цитохрома, сушку дезинтеграта, экстракцию липидов из биомассы и адсорбционную хроматографию липидов. Разрабо- танный метод получения лецитина позволяет получать целевой продукт с содержанием основного вещества около 90-96%.

Физико-химические свойства полученного дрожжевого лецитина сравнивались со свойствами яичного лецитина. Один образец последнего был получен от Харьковского предприятия по производству бактерийных препаратов ("Лецитин-стандарт"), другой - от Львовского КНПО "Диагностикум". Полученные результаты отражены в табл. 1.

В последние годы на мировом рынке появились новые косметические средства, содержащие биологически активные вещества, заключенные в липосомы. Известно, что от размера липосом во многом зависит способность их прохождения через слои кожи. Чем липосомы меньше, тем легче они проникают через кожу. Проведенные измерения липосом с помощью прибора Malvern Instruments MASTER Particle Sizer M31, дали следующие результаты, сведенные в табл. 3.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что лецитин, полученный из биомассы P.membranaefaciens, по своим свойствам не уступает лучшему яичному лецитину, производящемуся в нашей стране ("Лецитин-стандарту"). Получение ФХ из P. membaranaefaciens включает в себя меньше стадий, чем получение его из желтков куриных яиц. Сравнение стадий проводится в табл. 4.

Изобретение относится к медицине, а именно к косметологии, и касается способа получения фосфатидилхолина для получения мазей и кремов. Целью изобретения является сокращение числа стадий и удешевление целевого продукта. Сущность изобретения заключается в экстрации дрожжеподобных грибов /P. membranaefacien/, предварительно культивированных в питательной среде на этаноле, изопропанолом, упаривании экстракта и извлечении липидов из упаренного концентрата гексаном и адсорбционной хроматографией на силикагеле АСКГ. Положительный эффект заключается в сокращении числа стадий и замене источника получения фосфатидилхолина на сырье непищевого происхождения. 1 ил., 4 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФАТИДИЛХОЛИНА путем экстракции сырья органическим растворителем и очистки, отличающийся тем, что, с целью сокращения числа стадий и удешевления целевого продукта, в качестве сырья используют дрожжеподобные грибы (P. membranaefaciens), перед экстракцией их культивируют в питательной среде на этаноле, биомассу дезинтегрируют и сушат, экстракцию проводят изопропанолом, экстракт упаривают, а очистку проводят извлечением липидов из упаренного концентрата гексаном и адсорбционной хроматографией на силикагеле АСКТ.