СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA Российский патент 1995 года по МПК A61K39/35 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано для диагностики аллергических заболеваний, вызванных дрожжеподобными грибами (ДПГ) рода Candida - продуцентами биомасс кормового назначения.

Характерной особенностью предприятий, выпускающих такие биомассы, является присутствие особого биологического фактора: живых клеток микроорганизмов - продуцентов и белковой пыли микробной биомассы [1]. Как показали исследования [2 и 3] нахождение персонала в зоне циркуляции промышленного штамма ДПГ может приводить к сенсибилизации организма антигенами гриба. В то же время широкая распространенность ДПГ рода Candida в составе ценозов окружающей среды и нормальной микрофлоры человека ставит перед врачом задачу дифференциальной диагностики этиологии кандидосенсибилизации, которая должна проводиться с помощью специфических аллергенов. В настоящее время не существует специфических аллергенов для диагностики кандидосенсибилизации.

Известен способ получения аллергена из Candida maltosa выращенных на плотной среде Сабуро с 4% глюкозы, при котором аллерген экстрагировали из разрушенных механических путем клеток спиртовым раствором β-нафтола, экстракт отделяли из разрушенных клеток центрифугированием [4].

Недостатком способа является получение препарата с недостаточно высокой активностью и специфичностью.

Известны способы получения аллергенов путем экстракции из клеточных стенок и целых клеток Candida maltosa с последующей очисткой методом гельфильтрации на ультрагелях АсА и сефакриле S-200 [5].

Недостатком способов является низкая специфичность получаемых аллергенов.

Известен способ получения аллергена из среды культивирования Candida maltosa, при котором осветленную жидкую среду или экстракт из плотной среды после 7 с культивирования на них гриба очищали последовательно на катионите "Биокарб-Т" и ультрагеле АсА-44 [5].

Недостатком способа является резкое снижение в результате очистки активности аллергена.

Целью изобретения является повышение видовой специфичности аллергенного препарата.

Поставленная цель достигается тем, что культивирование биомассы проводят в ферментере в условиях контролируемого автоматического режима при концентрации глюкозы в среде от 0,6 до 0,8%, рН 5,5 рО₂ не ниже 80%, скорости перемешивания 1100 об/мин и температурном оптимуме роста объекта, культуральную жидкость концентрируют в 100 раз и разделяют путем мембранной фильтрации с последующим выделением субпродукта с молекулярной массой от 10 до 300 кД, который дополнительно фракционируют методом ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЕ-целлюлозы. Искомый продукт отбирают по признаку специфичности в процессе скрининга фракций путем аллерготестирования в гомологичной и гетерологичной системах.

Способ осуществляется следующим образом.

Культуру гриба выращивают в ферментере в условиях контролируемого стерильного циклического культивирования при следующем режиме: рН 5,5 рО₂ не ниже 80%, температурном оптимуме роста, скорости перемешивания 1100 об/мин, на жидкой минеральной среде с трехкратным добавлением глюкозы до содержания 0,6-0,8%.

Культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием на холоду при 5000 об/мин 15 мин, осветляют, пропуская через фильтр Зейтца, концентрируют на установке "Amicon" (полые волокна тип Н1Р8) в 10 раз и отмывают от низкомолекулярных компонентов, одновременно дополнительно концентрируя на мембране "Amicon" марки РМ-10.

Концентрат культуральной жидкости разделяют на молекулярной массе на мембране "Amicon" марки ХМ-300 в атмосфере азота при давлении 15 psi, после чего фильтрат, содержащий компоненты с молекулярной массой от 10 до 300 кД, концентрируют на мембране марки VM-2, доводя его объем до 20 мл.

Сконцентрированную на мембрану VNM-2 фракцию культуральной жидкости подвергают ионообменной хроматографии на колонке К 10/40 с ДЭАЕ-целлюлозой. В качестве стартового буфера используют 0,01 М трис HCl, содержащий 0,01 М NaCl, рН 5,5. Элюцию при ионообменной хроматографии проводят в градиентном режиме концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М. Выходящие с колонки фракции отмывают и концентрируют на мембрану VM-2 и исследуют их активность и специфичность путем аллерготестирования на морских свинках, сенсибилизированных культурой гомологичного штамма гриба и культурой Candida trapicalis, наиболее частого представителя естественных биоценозов окружающей среды и нормальной микрофлоры человека. Искомый продукт отбирают при скрининге фракций по признаку специфичности.

П р и м е р. Культуру Candida tropicalis штамм ВСБ 928 выращивают в ферментере в условиях контролируемого стерильного циклического культивирования при рН 5,5, рО₂ не ниже 80%, температуре 35^оС и скорости перемешивания 1100 об/мин на жидкой среде с трехкратным добавлением глюкозы до 0,6-0,8%. Взвесь среды с выросшей биомассой центрифугируют в течение 15 мин при 5000 об/мин. Выпавшие в осадок клетки отбрасывают.

Центрифугат фильтруют через фильтр Зейтца и концентрируют на установке "Amicon" (полые волокна тип Н1Р8) 10 раз, а затем отмывают от низкомолекулярных компонентов, дополнительно концентрируя на мембране "Amicon" марки РМ-10.

Концентрат культуральной жидкости фракционируют на мембране "Amicon" марки ХМ-300, после чего фильтрат, содержащий компоненты с молекулярной массой от 10 до 300 кД, концентрируют на мембране VM-2, доводя объем до 20 мл, и подвергают ионообменной хроматографии на колонке К 16/40 с ДЭАЕ-целлюлозой. В качестве стартового буфера используют 0,01 М трис HCl, содержащий 0,01 М NaCl рН 5,5. Элюцию проводят в градиентном режиме концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М. Фракции собирают, отмывают и концентрируют на мембране VM-2. Концентрацию белка в полученных фракциях определяют методом Лоури.

Фракции исследуют в аллерготесте на морских свинках, сенсибилизированных гомологичной культурой гриба (Candida tropicalis штамм ВСБ 928) и гетерологичной культурой Candida albicans в дозе, которая вызывает развитие гиперчувствительности замедленного типа у 100% животных. Рассчитывают и сравнивают среднеразрешающие дозы фракций при аллерготестировании в гомологичной и гетерологичной системах.

Специфический аллерген выходит в первом пике с фронтом стартового буфера.

Полученный материал стандартизируют по содержанию белка (1 мг/мл), разливают по ампулам и замораживают при -20^оС.

Как показали результаты экспериментов на 180 животных, полученное средство не вызывает ложноположительных реакций у контрольной группы животных в дозе, выявляющей гиперчувствительность замедленного типа у 100% сенсибилизированных животных. Минимальная реактогенная доза аллергена не менее чем в 10 раз превышает дозу, выявляющую сенсибилизацию у 100% животных.

Активность препарата, полученного по конкретному примеру, оцениваемая по величине его среднеразрешающей дозы при аллерготестировании на животных, сенсибилизированных гомологичной культурой гриба, составляет 0,5 (0,4-0,75) мкг белка на животное массой 200 г. Эта доза выявляет гиперчувствительность замедленного типа у 50% животных, сенсибилизированных Candida tropicalis штамм ВСБ 928, но не выявляет ее ни у одного животного, сенсибилизированного Candida albicans. В дозе 5 мкг белка животное аллерген выявляет сенсибилизацию к Candida tropicalis у большинства животных, а к Candida albicans - у единичных животных.

Как показали эксперименты, полученное средство обладает выращенной активностью и относительно высокой видовой специфичностью.

Полученное средство может быть использовано как диагностикум для дифференционированного анализа кандидосенсибилизации при периодических медицинских осмотрах лиц, работающих в производстве биомасс кормового назначения, и при решении вопроса о профессиональном характере выявленного у них аллергического заболевания.

Использование: аллерген, дрожжеподобный гриб, кандидоносительство, диагностика. Сущность изобретения: штамм Candida tropikalis ВСБ 928 выращивают в ферментере в жидкой среде в режиме циклического культивирования при pH 5,5, насыщении кислородом pO₂ не ниже 80% с поддержанием уровня глюкозы в среде 0,6 - 0,8%. Отделенную культуральную жидкость концентрируют, пропуская через полые волокна марки HIP8, и разделяют методом мембранной фильтрации. Полученный аллергенсодержащий материал с молекулярной массой от 10 до 300 кД подвергают фракционированию на ДЭАЕ-целлюлозе с последующим скринингом в аллерготесте в гомологичной и гетерологичной системах. Полученный аллерген может быть использован для диагностики заболеваний, вызванных дрожжеподобными грибами вида Candida tropikalis - процентами биомасс кормового назначения.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА ГРИБАМИ РОДА CANDIDA, включающий выращивание штамма - продуцента в жидкой питательной среде, отделение культуральной жидкости, ее концентрирование с последующей очисткой аллергенсодержащего материала и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Candida tropicalis ВСБ 928, выращивание ведут в режиме циклического культивирования при рН 5,5, насыщении кислородом рО₂ не ниже 80% с поддержанием уровня глюкозы в среде 0,6-0,8 мас.%, концентрирование культуральной жидкости осуществляют последовательно на полых волокнах и мембранах с пределами задержания 10 кД, очистку аллергенсодержащего материала проводят ультрафильтрацией на мембране с пределом задержания 300 кД, ультрафильтрат концентрируют, подвергают фракционированию ионнообменной хроматографией на ДЭАЕ-целлюлозе в градиенте концентраций NaCl от 0,01 до 0,5 М, полученные фракции скринируют в аллерготесте в гомологичных и гетерологичных системах и выделяют целевой продукт, представляющий фракцию с максимальной специфической активностью.