СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ Российский патент 1994 года по МПК C12N9/96 C12N9/22 

Изобретение относится к энзимологии, конкретно к способу стабилизации фермента дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) при термической обработке или длительном хранении его водных растворов.

ДНК-азу получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота и применяют в медицинской практике для разижения гноя при абсцессах легких, острых катарах верхних дыхательных путей, бронхоэктатической болезни, пневмонии и т.п. заболеваниях [1].

Однако ДНК-аза в водных растворах быстро инактивируется при хранении на холоду (2-6^оС) и особенно при воздействии повышенных температур (37-60^оС), что ограничивает возможности практического использования фермента.

Известен способ стабилизации водных растворов ферментов, в том числе, ДНК-азы, с помощью введения в эти растворы рассчитанных количеств анионных поверхностно-активных веществ или жирных кислот со средней длиной цепи [2].

Недостаток известного способа заключается в том, что предлагаемые соединения не защищают полностью растворы ферментов, подвергшиеся длительному хранению или воздействию высоких температур, от инактивации, и степень сохранения их активности не превышает 50%.

Наиболее близким к изобретению, принятым за прототип является способ стабилизации ДНК-азы, основанный на добавлении к ферменту ингибитора инактивации - парааминобензойной кислоты [3].

Однако такой прием позволяет продлить срок годности фермента лишь в порошкообразном состоянии (на 1-2 года) и практически не защищает молекулу ДНК-азы от разрушения при хранении ее водных растворов, особенно при нагревании их выше 60^оС. Последнее обстоятельство не позволяет комбинировать ДНК-азу с различными лечебными препаратами, растворимыми только при нагревании, что сужает область терапевтического применения фермента.

Целью изобретения является увеличение сроков хранения ДНК-азы в водных растворах.

Это достигается тем, что в способе стабилизации ДНК-азы, включающем растворение фермента в воде, добавление ингибитора инактивации и перемешивание смеси, в качестве ингибиторов инактивации используют смесь гидрохлорида пиридоксина и борной кислоты, при этом на 100 мас.ч. ДНК-азы берут 5-10 мас.ч. гидрохлорида пиридоксина и 1-2 мас.ч. борной кислоты.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявленное техническое решение отличается от известного иными приемами обработки фермента, в результате чего достигается предотвращение его инактивации при хранении или термической обработке. Таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию изобретения "существенные отличия".

Совокупность существенных признаков, заявленных в предлагаемом изобретении, в известных технических решениях обнаружена не была. Таким образом, сказанное позволяет сделать вывод о соответствии заявленного технического решения критерию изобретения "новизна".

Использованные в заявленном способе существенные признаки являются логическими обоснованными.

Известно, что соединения, являющиеся производными пиридина и обладающие активностью витамина В₆ (объединяемые общим названием "пиридоксины"), стабилизируют нативную конформацию белков в водных растворах, не вступая с этими белками в химическое взаимодействие [4]. Выбор в качестве ингибитора инактивации гидрохлорида пиридоксина объясняется его легкой растворимостью в воде, что в отличие от других труднорастворимых соединений этой группы (например, пиридоксальфосфата) облегчает возможности его использования по целевому назначению, не оказывая заметного влияния на ферменты других классов.

Известно, что водные растворы ДНК-азы без добавления ингибиторов инактивации теряют активность через 12 ч хранения при 2-6^оС или через 15 мин нагревания при температуре выше 55^оС [1]. Иная картина наблюдается при использовании ингибиторов инактивации, стабилизирующих молекулу фермента. При этом важно отметить, что для предотвращения инактивации ДНК-азы особое значение приобретает количественное соотношение ингибиторов инактивации и феpмента. При добавлении к 100 мас.ч. ДНК-азы 5-10 мас.ч. гидрохлорида пиридоксина инактивация водного раствора фермента не происходит при его нагревании при 60^оС в течение 6-8 ч или при хранении при температуре 2-6^оС в течение 4-6 сут в то время как при снижении концентрации гидрохлорида пиридоксина (менее 5 мас.ч./100 мас.ч. фермента) водные растворы ДНК-азы инактивируются на 50-60% уже через 30-45 мин, нагревания при 60^оС или через 12-14 ч хранения при 2-6^оС. При увеличении концентрации гидрохлорида пиридоксина (более 10 мас. ч. /100 мас.ч. фермента) добиться более продолжительной устойчивости ДНК-азы к спонтанному хранению или к воздействию повышенных температур не удается, что свидетельствует об экономической нецелесообразности использования больших количеств гидрохлорида пиридоксина.

Особенно заметно повышается устойчивость водных растворов ДНК-азы при обработке их комбинациями гидрохлорида пиридоксина и борной кислоты, которую добавляют из расчета 1-2 мас.ч./100 мас.ч. фермента. В этих случаях растворы ДНК-азы не теряют активность при их нагревании при 60^оС в течение 9-10 ч или при хранении при 2-6^оС в течение 10-12 сут.

При уменьшении концентрации борной кислоты (менее 1 мас.ч./100 мас.ч. фермента) преимуществ такой добавки не проявляется, а при повышении концентрации Н₃ВО₃ более выраженного эффекта предотвращения инактивации ДНК-азы не наблюдается. Также не было зарегистрировано положительного эффект при добавлении Н₃ВО₃ к ДНК-азе без гидрохлорида пиридоксина.

П р и м е р 1. 100 мг препарата дезоксирибонуклеазы (во всех примерах использовали фармакопейный препарат дезоксирибонуклеазы с активностью 1700 ед/мг) растворяют в 10 мл воды, добавляют 5 мг гидрохлорида пиридоксина и 1 мг борной кислоты, смесь перемешивают до растворения ингредиентов и раствор делят на две равные части. Одну часть нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 2^оС. При этом в первой пробе исходная специфическая активность фермента полностью сохраняется в течение 9 ч (активность ДНК-азы определяли по образованию кислоторастворимых продуктов, освобождаемых препаратом из ДНК), а во второй - в течение 10 сут.

П р и м е р 2. 100 мг препарата дезоксирибонуклеазы растворяют в 10 мл воды, добавляют 7,5 мг гидрохлорида пиридоксина и 1,5 мг борной кислоты, смесь перемешивают до растворения ингредиентов и раствор делят на две равные части, одну из которых нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 4^оС. При этом в первой пробе наблюдается полное сохранение исходной специфической активности фермента в течение 9,5 ч, а во второй - в течение 11 сут.

П р и м е р 3. 100 мг препарата дезоксирибонуклеазы растворяют в 10 мл воды, добавляют 10 мг гидрохлорида пиридоксина и 2 мг борной кислоты, смесь перемешивают до растворения ингредиентов, раствор делят на две равные части, одну из которых нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 6^оС. При этом в первой пробе наблюдается полное сохранение исходной специфической активности фермента в течение 10 ч, а во второй - в течение 12 сут.

При изменении заявленной совокупности признаков положительный эффект не достигается, что подтверждается сравнительными примерами 4-9.

П р и м е р 4. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 4 мг гидрохлорида пиридоксина и 0,5 мг борной кислоты. После перемешивания раствор делят на две равные части, одну из которых нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 2^оС. В первой пробе уже через 45 мин активность фермента снижается до 850 ед/мг (50% от исходной активности), а во второй пробе уже через 14 ч активность препарата снижается до 1020 ед/мг (60% от исходной).

П р и м е р 5. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 11 мг гидрохлорида пиридоксина и 3 мг борной кислоты, раствор после перемешивания делят на две равные части, одну из которых нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 2^оС. В обеих пробах полное сохранение активности наблюдается, как и в примере 3, соответственно в течение 10 ч и 12 сут. Таким образом, дополнительное увеличение концентрации ингибиторов инактивации не приводит к получению положительного эффекта и потому является экономически нецелесообразным.

П р и м е р 6. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 1 мг борной кислоты, после перемешивания раствор делят на две равные части, одну из которых нагревают при 60^оС, а другую выдерживают при 2^оС. В первой пробе уже через 30 мин активность фермента снижается до 425 ед/мг (25% от исходной), а во второй - через 1 сут до 260 ед/мг (15% от исходной).

П р и м е р 7. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 2 мг борной кислоты и далее поступают, как в примере 6. В первой пробе уже через 30 мин активность фермента снижается до 450 ед/мг (26% от исходной), а во второй - через 1 сут до 285 ед/мг (16,7% от исходной).

П р и м е р 8. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 5 мг гидрохлорида пиридоксина и далее поступают, как в примере 1. При этом в первой пробе активность фермента полностью сохраняется в течение 6 ч, а во второй - в течение 4 сут.

П р и м е р 9. 100 мг препарата ДНК-азы растворяют в 10 мл воды, добавляют 10 мг гидрохлорида пиридоксина и далее поступают, как в примере 1. При этом в первой пробе полное сохранение активности фермента наблюдается в течение 8 ч, а во второй - в течение 6 сут.

Использование: относится к биотехнологии, конкретно к способу стабилизации фермента дезоксирибонуклеазы, применяемого в медицинской практике для разжижения гноя при абсцессах легких, острых катарах верхних дыхательных путей, бронхоэктатической болезни, пневмонии и т.п.заболеваниях. Сущность изобретения: в раствор дезоксирибонуклеазы в качестве ингибитора инактивации вносят смесь гидрохлорида пиридоксина и борной кислоты, при этом на 100 мас. ч. дезоксирибонуклеазы берут 5 - 10 мас.ч. гидрохлорида пиридоксина и 1 - 2 мас.ч. борной кислоты.

СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ, предусматривающий растворение фермента в воде, введение ингибитора инактивации и перемешивание, отличающийся тем, что, с целью увеличения сроков хранения дезоксирибонуклеазы в водных растворах, в качестве ингибитора инактивации используют смесь гидрохлорида пиридоксина и борной кислоты из расчета 5 - 10 мас.ч. и 1 - 2 мас.ч. соответственно на 100 мас.ч, дезоксирибонуклеазы.