Способ получения протеинов из яичного белка Советский патент 1980 года по МПК A23J1/08 

Изебретение относится к комплексному получению протеинов из яичного белка, например лизоцима, овальбумина, овоглобулина, использу емых как сырье для получения аминокислот в медицине, косметике, микробиологической и пищевой промышленности. Известен способ получения протеинов из яичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракщ1Й лизодима,. овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией 1. Оцнако недостатками известного способа являются низкая активность препарата лизоцим недостаточная чистота овоглобулина и овальбумина, сложность и длительность процесса, связанная с многократностью перекристаллизацией и стадий очистки. Целью изобретения является повышение активности препарата лизоцима, чистоты овоглобу лина и овальбумина, упрощение процесса получения протеинов и обеспечение, высокого Их вы хода. Поставленная цель достигается тем, что перед осаждением фракций яичный белок вьщерживают при рН 4,8-5,3, температуре 17-22 в течение 48-72 ч, и отделяют выделившийся побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют из раствора, отделенного от осажденного овомуцина. Предлагаемый способ обеспечивает активность лизоцима 25000-30000 ед/мг белка, чистоту овоглобулина - 100%, чистота овальбумина - 100%, с высокими вьтходами и упрощение процесса. Увеличение активности лизоцима достигается за счет того, что в процессе выдерживания яичного белка при рН 4,8-5,3 и температуре 17-22С в течение 48-72 ч происходит (активация исходного сырья, что приводит в итоге к разложению фермент-белкового комплекса и освобождения лизоцима. В исходном сырье лизоцим связан с другими белками, что ведет к обратимой потере его активности. В процессе выдерживания исходного сырья происходит освобождение фермента от белка. Кислая среда рН 4,8-5,3 разрущает связь лизоцима с другими белками. Тем создаются условия для восстановления, активности лизоцима. 3.7 В процессе выдерживания яичного белка происходит освобожденне активного центра лизоцима, который в исходном сьфье частично блокирован неактивной, частью фермента, так как фермент находится в виде агрегатов друг с другом. Предлагаемое изобретение обеспечивает также получение овоглобулина и овальбумина высокой чистоты вследствие того, что в процессе активации сырья происходит осаждение побочных белков, включая овомуцин. Переход овомуцина в твердую фазу способствует его удалению. Дальнейшему фракционированию подвер гают жидкую фазу, не содержащую примес«й побочных белков, что повышает чистоту выделяемых протеинов. Осаждение овомуцинов в процессе активации сырья одновременно обеспечивает упрощеmie процесса очистки, т.е. за счет сокращения количества перекристаллизации овоглобулина и овальбумина с 5-ти до 2-х раз и количество перекристаллизации лизоцима с 3-х до 2-х раз. Пример 1.К60л яичного белка при перемешивании добавляют 1н раствор соляной кислоты до значе шя рН 5,0. Смесь оставляют при 20° С. Осаждается слизистый осадок, состоящий в основном из овомуцина. Кристаллизация лизоциШ. Через 72 ч осадок удаляют декантацией, а к жидкости при перемешивании добавляют NaCI до получения 5%-ного раствора и раствор едкого натрия до рН 9,5. Перемешивание продолжают до полного растворения соли. К приготовленному раствору для кристаллизации лизоцима прибавляют 10-25 мл суспензии кри сталлов лизоцима и оставляют при 5° С. Раствор каждый день- 2-3 раза перемешивают. Кристаллизация лизоцима заканчивается в течение 6 сут. Кристаллы лизоцима собирают центрифугированием и перекристаллизовывают, а центрифугат используют для получений овоглобулнна и овальбумина. Осадок технического лизоцима растворяют в 3 л 0,05 раствора уксусной кислоты, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и еще раз растворяют в 1 л 0,05 растворе уксусной кислоты и опять центрифугируют. Осадок отбрасывают, а центрифугаты объединяют. К центрифугатам добавляют натрий хлористый из расчета, чтобы получить 5%-ньш раст вор и 1 н раствор едкого натрия до рН 9,5. Раствор оставляют при 5° С ив течение 3 сут заканчивается перекристаллизация. Вьшавший осадок перекристаллнзовывают еще 1 раз как описано- Сырой осадок лизоцима после второй перекристаллизации собирают на нутч-фильтре и высушивают лиофильно. Активность лизоцима 30 ОШ ёд/мг, выход - 150 г. Затем к раствору яичного белка {объем около 60 л) после отделения лизоцима при перемешивании постепенно дoбaвляюt насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1,06. Образуется осадок, состоящий из овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Осадок собирают центрифугированием и подвергают дальнейшей очистке для нолучешя овоглобулнна, а центрифугат нспользуют для получения овальбумина. Осадок технического овоглобулина 1эастворяют в 2,0 л деминерализованной воды. К раствору добавляют при перемепливании 2,0 л насыщенного раствора сульфата аммония для переосаждения овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре и через 6-12 ч центрифугируют. Полученный продукт растворяют и осаждают подобным же образом еще 2 раза. После трехкратного осаждения осадки овоглобулина растворяют в минимальном количестве воды, диализируют через целлофан против деминерализованной воды 72-96 ч. Во время диализа образуется осадок овоглобулин, который собирают центрифугированием. Осадок растворяют в минимальном количестве 5%-ного раствора сульфата аммония. - 60 г овоглобулина. Чистота - 100% по хроматографическим данным. К центрифугату после отделения овоглобулина при перемешивании добавляют насьвденньш раствор сульфата аммония до тех пор, пока раствор не приобретает устойчивое помутнение. В этот момент прибавляют 0,2 н раствор серной кислоты до рН 5,1. Суспензию оставляют при 20° С. Кристаллизация овальбумина завершается в те4eiffle 24-48 ч. Кристаллы овальбумина собирают центрифугированием. НСидкость отбрасывают, а осадок перекристаллизовывают. Кристаллы овальбумина растворяют в 5 л деминерализованной воды. К раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (4;5 ± 0,5 л) до. тех пор, пока жидкость не приобретет интенсивную и устойчивую опалесценцию, в раствор вносят кристаллическую затравку и оставляют при 20° С. Через 48 ч кристаллизация заканчивается. Полученный продукт перекристаллизовывают таким же образом еще раз. После перекристаллизации овальбумнн, растворяют в минимальном количестве воды и подвергают диализу через целлофан до отсутствия сульфата аммония. Обессоленный раствор овальбумика высушивают лиофильно. Выход 650 г овальбумина. Чистота - 100% по хроматографическим данным. Пример 2. 60л яичного белка вливают в стеклянный реактор. Активность лизоцима в исходном сырье 22000 ед/мл. К белку при перемещивании механической мешалкой медленно добавляют 1 н раствор соляной кислоты до рН 5,3. ,Смесь оставляют при 22° С на 48 ч. В течение указанного времени активность лизо574цима в яичном белке повышается до 48000 ед/м и одьовременно осаждаются побочные белки. Осадок удаляют декантацией, а хсидкую фазу используют для получения лизоцима, овоглобулина и овальбумина, как описано в предьздущем примере. Выход лизоцима 155 г.. Активность Лизоцима 26400 ед/мг белка. Выход овоглобулина - 62 г. Содержание основного вещества - 100%. Выход овальбумина 700 г. Чистота препарата - хроматографически чи& Примерз. До обработки яичного бел-, ка определяют активность лизоцима, которая соответствует 23500 ед/мл, К 70 л яичного белка при перемешивании механической мещалкой добавляют 1 н раствор соляной кислоты до рН 4,8 и смесь оставляют при 18° С. Через несколько часов яичный белок мутнеет за счет осаждения побочных белков. Через 72 ч осадок удаляют декантацией и отбрасывают, в жидкой фазе определяют активность лизоцима, которая равна 46500 ед/мл. . Обработанный яичный белок при рН 4,8 и 18° С в течение 72 ч используют в качестве сырья для получения лизоцима, овоглобулина и овальбумина по способу, изложенному в примере 1. Выход лизоцима 17Q г или 75% от теоретического содержания. Активность лизоцима 28000 ед/мг белка. Выход овоглобулина 65 г. Чистота овоглобулина - хроматографически чистый. Выход овальбумина 800 г или 60% от теоретического содержания. 6 Чистота овальбумина - содержание осиовного вещества 100% по хроматографическим данным. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество биохимпрепаратов: яизоцима, овоглобулина, овальбумина. Активация съфья и отделение побочных белков обеспечивают увеличение активности лизоцнма в 1,5-2 раза, повыщение чистоты овоглобулина с 95-97% до 100% чистоты овальбумина с 95-98% до Формула изобретения Способ получения протеинов из яичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лизо1и{ма, овоглобулина, овальбумина с последующей их очисткой кристаллизацией, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода указанных фракций, упрощения способа, 1}рвыщения активности лизоцима и чистоты овоглобулина и овал бумина, перед осаждением фракций яичный белок вьздерживают при рН 4,8-5,3, температуре 17-22° в течение 48-72 ч и отделяют выделившийся побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют из раствора, овделенного от осажденного овомуцина. Источники информации, принятые во внимание при зкспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 247703, кл. А 23 J 1/08, 1968.