СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА ИЗ ЯИЧНОГО БЕЛКА Российский патент 1997 года по МПК A61K38/01 C12N9/36 

Изобретение относится к технике получения из яичного белка лизоцима, используемого как консервирующая добавка в ветеринарии, медицине, пищевой промышленности.

Известен способ получения лизоцима, при котором яичный белок обрабатывают растворами хлористого натрия и едкого натра с последующим отделением кристаллов лизоцима из раствора [1]
Недостатком известного способа является низкая активность полученного лизоцима, сложность и длительность процесса. Полученные при этом способе засоленные отходы яичного белка и продукты из него находят весьма ограниченное применение.

Известен способ получения лизоцима из яичного белка путем обработки неразведенного яичного белка ионообменными сорбентами с последующей десорбцией лизоцима водными растворами солей. В качестве ионообменного сорбента используют макропористые слабокислотные катиониты, например, "Дуолит С-464" [2] Согласно этому способу нативный, неразведенный водой или буферными растворами яичный белок приводят в контакт со слабокислотным катионитом в реакторе, затем катионит отмывают от балластных белков солевым раствором с концентрацией солей не выше 0,2 М или водой и затем элюируют лизоцим водным раствором соли, например, 0,1 М натрийфосфатным буфером (рН 7,5-8,3), содержащим 0,15 М хлорида натрия. Далее в собранный элюат добавляют неорганическую соль для кристаллизации или высаливания лизоцима, или элюат обеспечивают для последующей сушки.

Использование слабокислотных катионитов типа "Дуолит" впервые позволило получать лизоцим так, что из сырья извлекался лишь целевой продукт, причем потребительские свойства яичного белка после этого практически не изменялись. Это сделало возможным полноценно использовать отход в хлебопекарном, кондитерском производстве, при выработке порошковых продуктов, что обусловило широкое распространение этого способа. Способ, однако, не лишен недостатков.

К наиболее существенным недостаткам указанного способа относится следующее:
все слабокислотные катиониты, в том числе и "Дуолит", сильно (в 3-5 раз) изменяют свой объем при изменении рН или ионной силы уравновешивающих их растворов, что делает практически невозможным проведение хроматографического процесса в колонке. Осуществление такого процесса в промышленном масштабе возможно лишь в реакторе, что технически сложнее и сопряжено к тому же с сильным износом катионита;
лишь относительно небольшие количества яичного белка могут быть обработаны за 1 цикл определенным количеством слабокислотного катионита (3-4 объема белка 1 объемом катионита);
после обработки катионита солевыми растворами с целью десорбции лизоцима последний извлекается в виде сильно разбавленного раствора (1-3 мг/мл), который может содержать большие (до 50%) количества балластных белков.

В целом указанные недостатки приводят к усложнению технологии и удорожанию лизоцима.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа получения лизоцима из яичного белка, который позволил бы вести не реакторный, а колоночный процесс, обрабатывать большие количества сырья с малыми затратами сорбентов и получать достаточно чистый элюат с высокой концентрацией лизоцима.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Яичный белок пропускают через колонку с сильнокислотным (рКа 1-2) макропористым катионитом, в частности КУ-2П, а десорбцию лизоцима ведут элюентом с рН 8,5-13,2. В состав элюента может входить сода или поташ в концентрации 0,05-2 М. Элюент может содержат дополнительно и другие неорганические соли хлориды или сульфаты или фосфаты натрия или калия, в концентрациях меньших или равных концентрации соды. В состав элюента также может входить этиловый спирт в концентрации 10-40%
Использование ненабухающих макропористых сильнокислотных катионитов обеспечивает возможность получения лизоцима в колоночном процессе, что позволяет увеличить производительность способа и удешевить получение лизоцима.

Используемые вещества сода, поташ, нейтральные соли и этанол являются эквивалентами с точки зрения их ослабляющего влияния на электростатические взаимодействия полиэлектролитов в воде. Указанный диапазон значений рН обусловлен тем, что при рН ниже 8,5 не происходит десорбция лизоцима, а при рН выше 13,2 лизоцим быстро теряет активность. Указанный диапазон значений концентраций соды определяется тем, что при концентрации ниже 0,05 М не происходит десорбции лизоцима, а при концентрации выше 2 М происходит "высаливание" лизоцима на катионите, что также снижает степень десорбции. Указанные значения концентраций этанола определяются теми же обстоятельствами.

Конкретные значения концентраций солей в пределах указанного диапазона выбирают, исходя из характера последующих процедур. Так, если после десорбции проводят обессоливание элюата с последующей его сушкой, то целесообразно использовать элюент с низкими концентрациями солей (например, 0,1 М). Если же после десорбции проводят высаливание лизоцима из элюата, то целесообразно использовать элюент с высокими концентрациями солей (например, 0,4 М). Приемлемыми с точки зрения экономики процесса являются концентрации (суммарные) солей 0,4 М, этанола 20% В общем, чем выше концентрация солей и этанола в элюенте, тем более концентрированным (но не менее, чем 10 мг/мг) получается целевой раствор лизоцима (элюат).

Способ осуществляют следующим образом.

Исходный яичный белок пропускают со скоростью 15-45 мл/час/см² через колонку с катионитом КУ-2П в количестве 7-15 объемов катионита. После этого сорбцию прекращают, а сорбент промывают 0,2 М хлоридом натрия в количестве, равном 4-х кратному объему катионита. Затем пропускают элюент до тех пор, пока весь лизоцим не десорбируется, со скоростью до 45 мл/час/см². После этого элюат можно обессоливать и сушить или проводить кристаллизацию лизоцима по известным методикам.

Примеры реализации способа.

Пример 1. Через колонку объемом 8 мл (1,8 • 2,1 см) с катионитом КУ-2П пропускали 200 мл яичного белка со скоростью 6 мл/час при температуре 20^oC, затем дистиллированную воду в количестве 30 мл, затем 0,11 NaOH (рН 13,2) в количестве 100 мл. В результате на катионите сорбировалось 70% исходного количества (по активности) лизоцима, десорбировалось 40% сорбированного лизоцима.

Примеры 2 15, приведенные в таблице иллюстрируют эффективность использования элюирующих растворов с разным составом солей, разным рН и разным содержанием этанола.

Пример 16. Через колонку объемом 0,8 л (10•10,2 см) с катионитом КУ-2П пропускали 8 л яичного белка со скоростью 420 мл/час, затем 3 литра 0,2 М NaCl, затем 2 л элюента состава 0,2 М NaCl, 0,2 М Na₂CO₃ и 30% этанола со скоростью 250 мл/час. В результате на катионите сорбировалось 83% исходного количества лизоцима, десорбировалось 80% от сорбированного количества лизоцима. Далее элюат обессоливали известным способом и подвергали лиофильной сушке. В результате получили 18 г препарата, содержащего влаги 3,0% воды 2,5% белка 94,5% с активностью 20000 ед/мг препарата.

Изобретение относится к способам получения лизоцима из яичного белка. Сущность изобретения заключается в получении лизоцима из неразбавленного яичного белка путем колоночного хроматографического процесса на катионите, обеспечивающего обработку за 1 цикл большого количества белка малым количеством катионита, получение элюата высокой чистоты с высокой концентрацией лизоцима. Для этого яичный белок пропускают через колонку с сильнокислотными макропористым катионитом, затем катионит промывают водой или раствором натрия хлорида с концентрацией не выше 0,2 М, после чего элюируют лизоцим, пропуская щелочные растворы неорганических солей с рН 8,5-13,2. В состав элюента могут входить сода Na₂CO₃ или поташ K₂CO₃, хлориды, сульфаты или фосфаты натрия или калия в концентрации 0,05-2 М, а также этиловый спирт в концентрации 10-40%. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения лизоцима из яичного белка путем обработки неразведенного яичного белка ионообменными сорбентами с последующей десорбцией лизоцима элюирующими растворами солей, отличающийся тем, что в качестве ионообменного сорбента используют сильнокислотные катиониты, а десорбцию осуществляют элюирующими растворами солей с рН 8,5 13,2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в состав элюирующего раствора вводят соду или поташ в концентрации 0,05 2 М. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что в состав элюирующего раствора дополнительно вводят хлориды, или сульфаты, или фосфаты натрия или калия в концентрации 0,05 2М. 4. Способ по п.1, или 2, или 3, отличающийся тем, что в состав элюирующего раствора дополнительно вводят этиловый спирт в концентрации 10 - 40%