ИНГИБИТОР ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1994 года по МПК C12N7/04 C12N7/00 

Изобретение относится к медицине.

Известно вещество, используемое в качестве ингибитора вируса иммунодефицита человека, - азидотимидин (АЗТ).

Однако этот препарат закупается за рубежом и для ингибирования вируса его необходимо применять в относительно больших дозах.

Целью изобретения является повышение специфичности вещества и его удешевление.

Это достигается тем, что в качестве ингибитора вируса иммунодефицита используют фермент L-лизин-α -оксидазу.

Фермент L-лизин-α-оксидаза обладает следующими признаками: субстратная специфичность: окисляет L-лизин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-гистидин; мол. м.: 114±39 КДа (при определении методом гель-фильтрации на сефадексе G-220 и гель-электрофорезе; структура фермента: четвертичная структура состоит из двух идентичных субъединиц с мол.м. 60 КДа каждая; изоэлектрическая точка: 4,25; рН оптимум: 7,7 ± 0,3 (в трис-гидрохлоридном буфере при 37^оС, субстрат L-лизин); диапазоны рН-стабильности: 5,5-9,0 (в ацетатном, фосфатном и трис-гидрохлоридном буферах при 45^оС в течение 20 мин, субстрат L-лизин); при рН 7,4 за 2 ч остаточная активность в плазме крови 75%, при рН 7,4 за 2 ч остаточная активность в трис-буфере 68%; термостабильность: активность падает с 60^оС (в фосфатном буфере рН 7,0); 37^оС в течение 48 ч - 100%; константа Михаэлиса: (1,4 ± 0,1) х x 10^-2 мМ (субстрат L-лизин); ингибиторы: Zn, Cu, Ba, Fe²⁺ (при их концентрации 10^-4 М).

Для изучения ингибирующего действия L-лизин-α-оксидазы на продукцию ВИЧ (тип ВИЧ-1) были использованы клетки МТ-4 (перевиваемая линия культивируемых ин витро Т-лимфоцитов человека), чувствительные к цитопатическому действию вируса. Параллельно действие фермента сопоставляли со стандартным препаратом, широкоиспользуемым в настоящее время для лечения больных СПИД-азидотимидином (АЗТ). В лунки 24-ячейного планшета стерильно вносили 1,8 мл суспензии клеток МТ-4 в концентрации 5 х 10⁵ клеток/мл в культуральной среде РРМI 1640 (содержащей 100 ед/мл ампицилина натриевой соли), содержащей различные концентрации препаратов. Препараты L-лизин-α-оксидазы готовили следующим образом: исходный фермент в количестве 100 мкл (уд. акт. 142 Е/мг) разводили средой РМ1 в соотношении 1:50 (до 5 мл) и фильтровали через стерилизующий миллипоровый фильтр. Далее из этого раствора стерильным наконечником отбирали 3,3 мкл и добавляли к 18 мл суспензии клеток (что с учетом объема добавленного к клеткам вируса 0,2 мл в каждую лунку составило 10^-3 Е фермента на 1 мл культуральной среды). В контроль вместо вируса добавляли 0,2 мл среды на лунку. Дальнейшее уменьшение концентрации фермента 10^-4 - 10^-6 достигали стандартными десятикратными разведениями.

Вирус для испытания препаратов получали из культуральной жидкости клеток МТ-4, который предварительно титровался на цитотоксичную активность. Вирус вносили в дозе 10^-4 - 10^-5 ЦПД (0,2 мл) - цитопатическая доза и доводили объем в каждой лунке до 2 мл. Антивирусное действие фермента проводили в сравнении со стандартной дозой 3 мкМ/мл АЗТ(табл.1/2).

Как видно из представленных результатов, АЗТ вызывает полное подавление вируса в дозе 3 мкМ/мл, L-лизин-α-оксидаза в дозах 10^-4 - 10^-5 Е/мл. При более низких концентрациях L-лизин-оксидазы уменьшения исходного титра ВИЧ не наблюдалось. Увеличение концентрации L-лизин-α-оксидазы, как видно из табл.1, вызывает цитотоксическое действие на клетки.

Таким образом, можно сделать вывод, что высокоочищенные препараты L-лизин- α-оксидазы в концентрации 10^-4 - 10^-5 Е/мл полностью блокируют репродукцию вируса иммунодефицита человека ин витро, не оказывая цитотоксического действия на клетки.

Во второй серии экспериментов изучалось антивирусное действие L-лизин-α-оксидазы в условиях, аналогичных первой серии опытов, только вместо 0,2 мл культуральной среды в лунки вносили вирус в дозе 10^-4 - 10^-5 ЦПД/02 мл (цитопатическая доза). Предварительно вирус титровали на культурах МТ-4. Готовили 10-кратные разведения вируса на среде РРМI 1640, и каждым разведением вируса (от 10^-1 до 10^-6) заражали по шесть лунок планшета с клетками. Далее планшет помещали в СО₂-инкубатор на 3-5 сут. при температуре 37^оС. Учет ЦПД проводили путем подсчета мертвых клеток. Положительной считали пробу, в которой процент мертвых клеток был в 2 раза выше по сравнению с контролем. Антивирусное действие L-лизин-α-оксидазы проводили в сравнении со стандартной дозой азидотимидина (АЗТ), которая составляет 3 мкМ/мл, т.е. рабочая доза L-лизин-α-оксидазы 10^-4 Е/мл в 1000 раз ниже по сравнению с АЗТ.

Использование L-лизин-α-оксидазы в качестве ингибитора вируса иммунодефицита человека позволяет повысить специфичность вещества, т.к. для ингиби- рования вируса необходимо в 1000 раз меньше вещества, чем АЗТ. Кроме того, расширяется отечественная база ингибиторов ВИЧ.

Использование: медицина. Сущность изобретения: в качестве ингибиторов вируса иммунодефицита человека используют фермент L-лизин- α - оксидаза. Фермент обладает следующими признаками: окисляет L-лизин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-гистидин, мол. м. 114± 39 КДа , изоэлектрическая точка 4,25; pH оптимум 7,7± 0,3 , термостабильность - активность падает с 60°С, ингибиторы - Zn, Cu, Ba, Fe²⁺ . 2 табл.

Применение L-лизин- α -оксидазы в качестве ингибитора вируса иммунодефицита человека.