АМИД β-ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С МЕТИЛОВЫМ ЭФИРОМ L -ГИСТИДИНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИ-СПИД-АКТИВНОСТЬ Российский патент 1994 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/705 

Изобретение относится к новому биологически активному соединению, конкретно, к амиду β -глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-гистидина: 3-0-[2-0-(β -D-глюкопиранозилураноил)- β-D-глюкопиранозилураноил]-(3 β, 20 β)-11,30-диоксо-30-(N-L-гистидина метиловый эфир)-30-норолеан- -12-ен формулы I
проявляющему анти-СПИД активность.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно проводятся исследования по поиску средств лечения СПИДа. Известно уже более 50 препаратов, подавляющих репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) in vitro [1]. Одним из таких препаратов является глицирризиновая кислота (ГК) [2-6]. Показано также, что введение ГК в высоких дозах (800-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение содержания ТЧ лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена [5] . Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени остается неустановленным. Однако, ГК малоэффективна как ингибитор репликации ВИЧ не хронически инфицированных клетках.

Целью настоящего изобретения является поиск нового соединения в ряду производных β -глицирризиновой кислоты, обладающих анти-СПИД активностью.

Поставленная цель достигается амидом β-глицирризиновой кислоты формулы (I), проявляющим анти-СПИД активность.

Фармакологические свойства описываемого соединения
Противовирусная активность описываемого соединения (I) изучалась на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4. Раствор амида в диметилсульфоксиде (ДМСО) (25 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 500-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0%. В предварительных опытах было установлено, что ДМСО в указанных концентрациях не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата).

В качестве препаратов сравнения использовали очищенную β -глицирризиновую кислоту (92-95%), эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках in vitro, и один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ), механизм действия которого связан с блокированием вирусной обработкой транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК [7]. Основным недостатком этого препарата является его высокая токсичность [8].

Установлено, что амид (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/мл (на 99,4-99,6%) (табл. 1). По уровню выявленной противовирусной активности соединение (I) аналогично АЗТ и β -ГК.

Соединение (I) менее токсично, чем АЗТ.

ЛД₅₀ амида (I) > 7000 мг/кг. Соединение I относится к III классу малоопасных веществ.

Синтез амида (I) проводят методом активированных (II-гидроксисукцинимидных) эфиров без предварительной защиты ОН-групп углеводной цепи молекулы гликозида. Выход амида (I) 43,9% . Аналитически чистый продукт получают путем перекристаллизации из диметилформамида - воды.

Таким образом, новое малоопасное производное β -глицирризиновой кислоты - амид (I), эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 in vitro (в культуре клеток МТ-4), менее токсично, чем азидотимидин, обладающий анти-СПИД активностью, аналогичной активности АЗТ и β -ГК.

П р и м е р 1. Изучение анти-СПИД активности.

Противовирусная активность амида I была изучена на модели первично инфицированных ВИЧ-1 лимфоидных клеток МТ-4 (in vitro). Растворы препаратов в ДМСО (20 мг/мл - 50 мг/мл) вносили в суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток до конечной концентрации препарата 500-1000 мкг/мл, ДМСО до конечной концентрации 0,5-2,0% . В предварительных экспериментах было установлено, что ДМСО в концентрациях 0,5-2,0% не блокирует репродукцию ВИЧ-1. Об ингибировании репродукции ВИЧ-1 в клетках судили по снижению активности обратной транскриптазы и снижению накопления вирусного антигена (методом иммуноферментного анализа) в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования по сравнению с контролем (без добавления препарата). В качестве препаратов сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения СПИДа препаратов - азидотимидин (АЗТ) и β -глицирризиновую кислоту (β -ГК), также эффективно ингибирующую репродукцию ВИЧ-1 в клетках. Результаты опытов приведены в таблице.

Как видно из данных таблицы, исследованное соединение (I) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток в концентрациях от 0,5 до 1,0 мг/мл. По антивирусной (анти-ВИЧ) активности соединение (I) аналогично АЗТ и β - ГК. Таким образом, впервые установлена способность амида β -глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-гистидина (I) эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток.

П р и м е р 2. Получение амида (I).

К раствору 1,64 г (2 ммоль) β -глицирризиновой кислоты (92-95%) чистоты в 50 мл сухого ДМФА при 0^оС прибавляют 1,2 г (10,4 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 1,3 г (6 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и перемешивают в ледяной бане 2-3 ч, при комнатной температуре 6 ч, оставляют на ночь в холодильнике, отфильтровывают осадок дициклогексилмочевины, к фильтрату, помещенному в ледяную баню, прибавляют 1,5 г (5,9 ммоль) метилового эфира L-гистидина (основания), 2 мл перегнанного триэтиламина и выдержали с периодическим перемешиванием 24 ч. Выливают смесь в холодную воду (300 мл), отфильтровывают осадок, промывают его водой и высушивают. Получают 0,96 г (49,2% ) амида (I), который переосаждают из ДМФА - Н₂О. Выход аналитически чистого продукта 0,86 г (43,9%); аморфное вещество желтоватого цвета, Т разл. 250-251^оС, [α ]_D²⁰ = +40^о (с = 0,01; диоксан-метанол);
ИК, ν, см^-1: 3600-3150 (ОН, NH); 1740 (СООМе); 1700 (СООН); 1660 (С=О); 1600 (имидазол); 1530 (NH).

УФ, λ_max^{диоксан-метанол} (lg ε): 220 нм (4,71); 265 нм (4,70).

Найдено, %: С 59,23; Н 6,98; N 4,46.

C₄₉H₆₇N₃O₁₇.

Вычислено, %: С 60,42; Н 7,35; N 4,31.

Использование: в качестве анти-СПИД средства. Сущность: продукт 3-0[2-0-( b -D-глюкопиранозилураноил)- b -D-глюкопиранозил-ураноил]-(3 b , 20 b )-11,30-диоксо-30-(N-L-гистидина метиловый эфир)-30-норолеан-12-ен, выход 43,9% БФ C₄₉H₆₇N₃O₁₇ . т.пл. 250 - 251°С [α]2D

Амид β - глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром L-гистидина общей формулы

где
R =
проявляющий анти-СПИД-активность.