N'-{N-[3-ОКСО-20(29)-ЛУПЕН-28-ОИЛ]-9-АМИНОНОНАНОИЛ}-3-АМИНО-3-ФЕНИЛПРОПИО НОВАЯ КИСЛОТА, ОБЛАДАЮЩАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2003 года по МПК C07J53/00 C07J63/00 A61K31/56 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к тритерпеноиду лупанового ряда формулы (I),

обладающему иммуностимулирующей и противовирусной активностью.

Указанное свойство позволяет предполагать возможность использования соединения в медицине в качестве фармацевтического препарата.

Синдром приобретенного иммунодефицита человека (AIDS, СПИД) является наиболее распространенной болезнью, которая до настоящего времени не поддается успешной химиотерапии. Это заболевание имеет ряд особенностей, заключающихся в том, что оно поражает систему защиты организма человека от всевозможных внешних инфекций. Кроме того, провирусный геном вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, интегрируется в геном лимфоцитов, поэтому зараженные лимфоциты вплоть до своей гибели способны производить новые копии вируса, инфицируя таким путем здоровые лимфоциты.

Известны 2 группы ингибиторов ОТ. 1-ая группа - нуклеозидные ингибиторы, служащие конкурентными ингибиторами по отношению к субстратам и блокирующие синтез цепи ДНК. Наиболее широко используемым препаратом этой группы является азидотимидин, который, несмотря на высокую ингибирующую активность, обладает рядом негативных качеств: высокая токсичность и быстрое возникновение устойчивых к действию препарата мутантов вируса.

Ненуклеозидные соединения составляют многочисленный класс потенциальных ингибиторов репликации ВИЧ. Эти соединения могут ингибировать различные стадии вирусной репродукции, включая этап обратной транскрипции вирусной нуклеиновой кислоты. Как правило, ненуклеозидные препараты менее токсичны для клеток организма, чем нуклеозидные ингибиторы из-за отсутствия ингибирующего эффекта на клеточные ДНК полимеразы [De Clercq E.//Meclical virology, 1996, v. 6, р. 97-117].

Высокая и разнообразная биологическая активность тритерпенов олеонанового и лупанового ряда (особенно антимикробная, противовирусная и противоопухолевая) делает эту группу соединений перспективной для поиска эффективных анти-ВИЧ агентов, а также иммуностимуляторов.

Известны тритерпены олеонанового ряда в качестве ингибиторов ВИЧ в культуре клеток [Kashiwada Y., Nagao Т., Hashimoto A., Ikeshiro Y., Okabe H., Cosentino L. M. , Lee K.- H.// J. Nat. Prod., 2000, v. 63, N 12, р. 1619-1622] . Описан синтез большого ряда производных бетулиновой кислоты и фармакологических композиций на их основе для изучения в качестве анти-ВИЧ и иммуномодулирующих агентов, однако количественные данные по активности соединений отсутствуют [US Patent N 5468888, 1995]. В работе [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L. M. Cosentino, C-H. Chen, P.E. Garrett, K.-H. Lee // J. Med. Chem. , 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017] приведены данные по анти-ВИЧ активности сукцинатов бетулина, а также производного бетулиновой кислоты (II), однако данные по иммуностимулирующей активности указанных соединений отсутствуют.

Среди тритерпенов найдены также высокоэффективные иммуностимуляторы, вошедшие в состав ISCOMs - иммуностимулирующих комплексов, состоящих из антигена, холестерина, фосфолипидов и сапонинов южноамериканского дерева Quillaia saponaria [Villacres-Eriksson M., Behboudi S., Morgan A.J, Trinchieri G, Morein B. // Cytokine, 1997, v. 9, p. 73-82]. Фракция сапонинов, активирующая иммунный ответ - QuilA - представляет собой смесь тритерпеновых гликозидов [Chavali S., Francis Т., Campbell J. // Int. J. Immunopharmacol., 1987, v. 9, р. 675-679]. Известна иммуностимулирующая активность циклоартрановых гликозидов - куркулигосапонинов С и F из Curculigo orchioides [Xu J. -P. , Xu R., Li X.-Y. // Phytochemistry, 1992, v. 31, N 1, p. 233-236]. Недостатком указанных препаратов является недоступность растительного сырья, проявление указанными препаратами иммуносупрессорных свойств при использовании в больших дозах, а также низкая эффективность при оральном введении.

Анализ литературных данных показывает, что синтез и биологические испытания индивидуальных соединений тритерпенового ряда, отличающихся от существующих меньшей общей токсичностью и большей эффективностью специфического действия, а также расширенным спектром антивирусного действия, является актуальным.

Аналогом по структуре и свойствам соединения (I) является глицирризиновая кислота (ГК) формулы (III). Описан выраженный противовирусный эффект ГК и некоторых ее производных. Так, моноаммониевая соль ГК полностью ингибирует in vitro репродукцию многих ДНК и РНК-содержащих вирусов (Herpes simplex, Varicella zoster, ВИЧ) [Плясунова О.А., Егоричева И.Н., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Балтина Л.А, Муринов Ю.И., Толстиков Г.А.// Вопросы вирусологии, 1992, 5-6, с. 235-238]. В малых дозах ГК и ее соли являются сильными иммуностимуляторами. Они увеличивают продукцию интерферона, интерлейкина-2 и усиливают экспрессию рецепторов к ИЛ-2 на поверхности Т-лимфоцитов, стимулируют пролиферацию Т- и В-лимфоцитов в культуре клеток селезенки мышей, стимулируют выработку AT, усиливают фагоцитарную функцию макрофагов, усиливают цитотоксичность естественных киллеров [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Шульц Э. Э. , Покровский А.Г.// Биоорганическая химия, 1997, т. 23, 9, с. 691-709. ] . Основным недостатком ГК в плане ее широкого применения является минералокортикоидное действие [Armanini D., Wehling M., Weber P.C.//J. Endocrinol. Invest., 1989, v. 12, р. 303-306.].

Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, проявляющих иммуностимулирующую и противовирусную активность и обладающих преимуществом перед известными структурными аналогами подобного действия.

Поставленная задача достигается новым химическим соединением указанной формулы (I), обладающим выраженной иммуностимулирующей активностью и проявляющим противовирусное действие в отношении ВИЧ-1 и вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1).

Синтез заявляемого соединения (I) проводили по приведенной в конце описания схеме. Исходным соединением для получения (I) является легко выделяемый из коры березы бетулин (содержание в коре достигает 25%). Бетулин по известному способу окисляли в бетулоновую кислоту (IV) [Kim Darrick S.H.L., Chen Z. , Nguyen V.T., Pezzuto J., Qiu S., Lu Z.-Z. // Synth. Commun, 1997, v. 27, p. 1607-1611]. Обработка бетулоновой кислоты оксалилхлоридом в хлористом метилене дает хлорангидрид (V), конденсацией которого с силиловым эфиром 9-аминопеларгоновой кислоты [Петренко Н.И., Петухова В.З., Шакиров М. М. , Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. // Журнал орган. химии, 2000, т. 36, вып. 7, с. 1013-1026] в присутствии триэтиламина получают соответствующий амид (VI). Реакция (VI) с β-фенил-β-аланином в присутствии N,N-дициклогексилкарбодиимида, 1-гидроксибензотриазола и триэтиламина в хлористом метилене и последующий гидролиз приводит к соединению (I) с общим выходом 44% на исходную бетулоновую кислоту.

Биологическая активность соединения формулы (I) изучалась путем определения иммуностимулирующего действия (при иммунизации сильным и слабым антигенами), исследования цитотоксичности в культурах клеток МТ-4, острой токсичности на мышах, а также исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ и ВПГ-1. Дополнительно определяли также острую токсичность на белых беспородных мышах обоего пола при внутрибрюшинном введении. LD₅₀ соединения составила > 2,0 г/кг. Заявляемое соединение относится к 3-му классу умеренно опасных веществ.

Иммуностимулирующие свойства патентуемого соединения изучали на белых беспородных мышах массой 18-20 г. Влияние соединения (I) на стимуляцию Т-клеточного иммунитета при введении сильного антигена эритроцитов барана (ЭБ) исследовали методом розеток [Фримель X. Иммунологические методы. / Пер. с нем., под ред. М.А. Фроловой. - М.: Мир, 1979, 518 с.]. Препаратом сравнения служил неполный адъювант Фрейнда (НАФ), а также ГК. Результаты приведены в табл. 1.

Как видно из табл.1, соединение (I) стимулирует образование розеток, его индекс стимуляции соответствует индексу стимуляции ГК.

Влияние соединения (I) на стимуляцию В-клеточного ответа определяли по увеличению титра специфических антител после иммунизации слабым антигеном - бычьим сывороточным антигеном (БСА). Препаратом сравнения служил препарат гидроокиси алюминия, применяемый в вакцинах в качестве адъюванта. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из приведенных данных, при иммунизации слабым антигеном соединение (I) проявляет выраженную иммуностимулирующую активность: титр специфических антител при иммунизации БСА совместно с исследуемым соединением увеличился в 256 раз по сравнению с контролем и оказался более чем в 10 раз выше, чем при использовании ГК в качестве иммуностимулятора.

Анти-ВИЧ активность оценивали по двум схемам, отличающихся временем внесения соединений в суспензию клеток: а) после адсорбции вируса, б) одновременно с вирусом. Препаратом сравнения служил высоко эффективный и широко применяемый в медицинской практике анти-ВИЧ препарат нуклеозидного типа азидотимидин (АЗТ). Результаты исследования приведены в табл. 3 и 4 и на фиг. 1.

Как видно из табл. 3, соединение (I) оказалось активным в отношении ВИЧ-1, хотя терапевтический индекс невысок (14). Кроме того, это соединение защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (PD₅₀ = 0,4 мкМ; IS=14). Дозозависимая кривая, иллюстрирующая этот эффект, приведена на фиг.1.

Учитывая данные о том, что амиды бетулиновой кислоты ингибируют ранние стадии вирусной репродукции (именно такой механизм действия установлен для структурного аналога (II)) [Mayaux J.-F, Bousseau A, Pauwels R., Huet Т., Henin Y., Dereu N., Evers M, Soler F., Poujade C., De Clercq E., Le Pecq J. -B. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1994, v. 91, p.3564-3566], было проведено исследование анти-ВИЧ активности заявляемого соединения при одновременном добавлении с вирусом к клеткам МТ-4 по схеме (б). Экспериментальные данные этого исследования приведены в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что при одновременном внесении с вирусом, соединение (I) обеспечивает 50%-ное ингибирование репродукции вируса при концентрации 0,0026 мкМ с индексом селективности 2135. Следует заметить, что важной характеристикой противовирусной активности соединения служат концентрации, которые вызывают 50 и 90% ингибирование накопления вируса. Сравнение этих характеристик позволяет более детально оценить эффективность соединений. Из приведенных данных видно, что концентрация (I), обеспечивающая 90% ингибирование вируса составляет ~0.2 мкМ (на порядок ниже, чем у азидотимидина). Кроме того, заявляемое соединение эффективно защищает клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия (PD₅₀ = 0,029 мкМ; IS=191), что хорошо видно на фиг.1. Эти данные позволяют предположить, что основное анти-ВИЧ действие заявляемого соединения связано с влиянием на ранние этапы цикла репродукции вируса, следующие сразу за связыванием вируса с клеткой. Другое объяснение значительного повышения эффективности действия агента при его раннем добавлении может быть связано с особенностями проникновения соединения в клетки. В случае медленной скорости проникновения соединения его эффективность будет существенно возрастать при предварительном добавлении препарата к клеткам.

По сравнению со структурным аналогом (II), ID₅₀ для которого в культуре клеток МТ-4 в отношении разных штаммов ВИЧ-1 составляет 0,045-0,75 мкМ [Y. Kashiwada, F. Hashimoto, L.M. Cosentino, C-H. Chen, P.E. Garrett, K.-H. Lee, J. Med. Chem. , 1996, v. 39, N 5, p. 1016-1017], анти-ВИЧ индекс селективности для соединения (I) превышает таковой для (II) как минимум на порядок. В качестве несомненного достоинства изобретения, следует отметить, что низкие ингибирующие концентрации (в 1000-10000 раз меньшие по сравнению с ГК) делают заявляемое соединение перспективным для перорального применения при терапии ВИЧ-инфекции. Это важно, так как одним из недостатков терапии вирусных инфекций ГК, а также других тритерпенов, является необходимость внутривенного введения препарата для достижения высоких концентраций в крови, необходимых для проявления противовирусной активности.

Противовирусную активность заявляемого соединения в отношении вируса простого герпеса 1 типа (ВГП-1) определяли на штамме L, полученном из Аmеrican Tissue Culture Collection (ATCC) с использованием клеток Нер-2 (перевиваемся эпителиальная культура клеток человека) и Vero (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки). Активность определяли при добавлении к клеточному монослою одновременно с вирусом. Препаратом сравнения служил широко применяемый в медицинской практике антигерпетический препарат ацикловир. Результаты представлены в табл. 5 и на фиг. 2.

Соединение (I), по-видимому, из-за токсичности не достигает ID₅₀ на клетках Vero, поэтому IS не определяется, тогда как на клетках Нер-2 эффективная доза для соединения (I) равна 0,5 мкг/мл, что в 20 раз ниже, чем для ГК, и находится на уровне ацикловира. ГК в культуре Vero оказывала выраженное противовирусное действие (ID₅₀ 1,0 мкг/мл), в то время как на Нер-2 требовалась значительно более высокая доза препарата для того же эффекта (ID₅₀ 10 мкг/мл). Как видно из табл. 5 и фиг. 2, значения по защите клеток заявляемым агентом на культурах Vero и Нер-2 различны, что не противоречит данным для широко применяемых препаратов. Так, значения ID₅₀ при изучении противовирусного действия на культурах Vero и HEL существенно различались для ацикловира (1,06 и 0,0061 мкг/мл соответственно), ганцикловира (5,32 и 0,067 мкг/мл соответственно) и пенцикловира (6,67 и 0.14 мкг/мл соответственно) [Neyts J. , Andrei G., De Clercq E. // Antimicrobal agents and chemoterapy, 1998, v. 42, p. 216-222]. Следует также подчеркнуть, что противовирусная активность для структурного аналога (II) неизвестна.

Таким образом, новое химическое соединение - N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил] -9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовая кислота - не токсично, обладает широким спектром антивирусной активности в сочетании с иммуностимулирующей активностью. Заявляемое соединение получается с высоким выходом из доступного отечественного сырья бетулина (содержание в коре березы достигает 25%).

Данное изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Синтез N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (I).

К соединению (IV) (2.82 г, 6.2 ммоль) в 70 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона прибавляли 1.1 мл (12.6 ммоль) хлористого оксалила, реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 6 ч и затем упаривали на роторном испарителе при температуре не более 30^oС. К остатку добавляли безводный хлористый метилен и снова упаривали, эту процедуру повторяли несколько раз, затем остаток промывали безводным серным эфиром. Получили 2.60 г (89%) хлорангидрида 3-оксо-20(29)-лупен-28-овой кислоты (V), т. пл. 209-212^oС.

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 472.31425. С₃₀Н₄₅O₂Сl. Вычислено: мол. масса 472.31079.

ИК-спектр (ν, см^-1): 1705 (С=O), 1804 (СOСl).

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 4.67 с и 4.57 с (2Н, =CH₂), 1.62 с (3Н, Me), 1.02 с (3Н, Me), 0.98 с (3Н, Me), 0.94 с (6Н, 2 Me), 0.89 с (3Н, Me).

Спектр ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.54 к, 15.56 к, 15.79 к, 19.19 к, 19.45 т, 20.86 к, 21.19 т, 25.22 т, 26.44 к, 29.41 т, 29.69 т, 32.02 т, 33.44 т, 33.92 т, 35.99 т, 36.77 с, 37.66 д, 39.49 т. 40.52 с, 42.35 с, 45.81 д, 47.15 с, 49.49 д, 49.80 д, 54.86 д, 67.61 с, 110.18 т, 149.04 с, 177.17 с, 217.73 с.

Смесь 2.2 ммоль (0.46 г) гидрохлорида 9-аминононановой кислоты, 4.4 ммоль (0.56 мл) свежеперегнанного триметилхлорсилана и 2.2 ммоль (0.31 мл) перегнанного триэтиламина в 100 мл безводного хлористого метилена кипятили 4 ч в атмосфере аргона, затем охлаждали до 0-5^oС и добавляли 2 ммоль (0.95г) хлорангидрида (V) и 3.2 ммоль (0.45 мл) перегнанного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали с периодическим перемешиванием при комнатной температуре в течение суток, затем разбавляли хлористым метиленом, промывали 10%-ным раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, сушили MgSO₄ и упаривали. Остаток хроматографировали на силикагеле (элюент - раствор, содержащий 5% ацетонитрила в хлороформе) и высушивали при 60^oС над Р₂O₅. Получили 0.75 г N-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-9-аминононановой кислоты (VI) (61%), т.пл. 96-98^oC, [α] +27^o (с 4.16, хлороформ).

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 609.47507. С₃₉Н₆₃NO₄. Вычислено: мол. масса 609.47568.

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 9.49 уш.с (1Н, СООН), 5.80 т (1Н, NH, J=5.3 Гц ), 4.65 с и 4.50 с (2Н, = СН₂), 3.22 м (1Н, ), 3.05 м (2Н, 1Н, ), 2.35 т (2Н, , J=8.0 Гц), 1.59 с (3Н, Me), 0.98 с (3Н, Me), 0.93 с (3Н, Me), 0.89 с (6Н, 2 Me), 0.84 с (3Н, Me). Спектр ЯМР ¹³С (δ, м. д. ): 14.29 к, 15.69 к (2С), 19.24 к, 19.38 т, 20.75 к. 21.23 т, 24.43 т, 25.38 т, 26.36 к, 26.64 т, 28.70 т, 28.79 т, 28.88 т, 29.14 т, 29.50 т, 30.60 т, 33.46 т (2С), 33.81 т, 33.87 т, 36.65 с, 37.50 д, 38.20 т, 38.98 т, 39.38 т, 40.44 с, 42.26 с, 46.41 д, 47.07 с, 49.74 д, 49.83 д, 54.74 д, 55.32 с, 109.10 т. 150.63 с, 176.00 с, 178.75 с, 218.28 с.

К раствору 0.97 г (1.6 ммоль) соединения (VI) в 150 мл безводного хлористого метилена при 0^oС в атмосфере аргона прибавляли при перемешивании 0.23 г (2 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 0.41 г (2 ммоль) N,N-дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивали 0.5 ч при 0^oС и 5 ч при комнатной температуре, затем охлаждали до 0^oС и прибавляли 0.45 г (2.1 ммоль) гидрохлорида метилового эфира β-фенил-β-аланина и 0.3 мл (2.1 ммоль) перегнанного триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали, периодически перемешивая, при комнатной температуре в течение суток, затем охлаждали до 0^oС, осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали и промывали охлажденным хлористым метиленом. Объединенные фильтраты промывали 10%-ным раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, сушили MgSO₄ и упаривали. Остаток растворяли в небольшом количестве хлористого метилена (~ 5 мл), раствор охлаждали до -10^oС, выпавший осадок отфильтровали, промывали охлажденным хлористым метиленом и фильтрат упаривали. Эту процедуру повторяли 2-3 раза, остаток высушивали в вакууме. К раствору 1.04 г полученного вещества в смеси 7 мл МеОН и 14 мл ТГФ прибавляли 1.4 мл 4 М раствора NaOH и реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение суток, затем выливали на смесь льда с разбавленной соляной кислотой. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакуум-эксикаторе над P₂O₅. Получили 0.97 г (81%) соединения (I), т.пл. 146-148^o, [α] +21^o (с 3.83, хлороформ).

Масс-спектрометрически найдено: мол. масса 756. C₄₈H₇₂N₂O₅. Вычислено: мол. масса 756.

Спектр ЯМР ¹Н (δ, м.д.): 9.80 уш.с (1Н, СООН), 7.30-7.13 м (5Н, Ph), 7.05 д (1Н, NH, J=8.6 Гц), 5.85 т (1Н, NH, J=5.2 Гц), 5.36 м (1Н, ), 4.66 с и 4.53 с (2Н, =СН₂), 3.16-3.01 м (3Н, , Н¹⁹), 2.80 м (2Н, СН₂), 2.15 т (2Н, , J=8.0 Гц), 1.62 с (3Н, Me), 1.00 с (3Н, Me), 0.95 с (3Н, Me), 0.91 с (6Н, 2Ме), 0.85с (3Н, Me).

Спектр ЯМР ¹³С (δ, м.д.): 14.31 к, 15.69 к (2С), 19.24 к, 19.43 т, 20.77 к, 21.26 т, 25.32 т, 25.42 т, 26.41 к, 26.50 т, 28.68 т (2С), 28.80 т, 29.16 т, 29.43 т, 30.63 т, 33.47 т (2С), 33.87 т, 36.34 т, 36.68 с, 37.54 д, 38.24 т, 38.99 т, 39.41 т (2С), 40.48 с, 42.29 с, 46.45 д, 47.07 с, 49.11 д, 49.77 д, 49.85 д, 54.77 д, 55.36 с, 109.15 т, 126.09 д (2С), 127.16 д, 128.32 д (2С), 140.65 с, 150.61 с, 172.76 с, 173.40 с, 176.20 с, 218.17 с.

Пример 2. Влияние соединения (I) на Т-клеточный иммунитет при иммунизации сильным антигеном.

В работе использовали нелинейных мышей, самцов массой 20-22 г. Животным вводили подкожно взвесь ЭБ (10⁷ клеток на мышь) с 200 мкг (10 мг/кг) исследуемого соединения в 0,5 мл физиологического раствора. Контрольным животным вводили ЭБ без соединения (I) (отрицательный контроль) или ЭБ с НАФ (положительный контроль); еще одна контрольная группа - неиммунные мыши. На 6 день после иммунизации готовили суспензию спленоцитов с концентрацией 10 живых клеток в 1 миллилитре. 0,9 мл суспензии спленоцитов и 0,1 мл суспензии эритроцитов (10⁹ клеток в миллилитре) помещали в пенфлаконы, перемешивали и инкубировали 16 ч при 4^oС. После инкубации в пенфлаконы вносили по 4 мл холодной среды, осторожно перемешивали; пипеткой с широким носиком отбирали 100 мкл суспензии клеток, окрашивали трипановым синим 0,4% и считали количество розеток в камере Горяева [Фримель X. Иммунологические методы. / Пер. с нем., под ред. М.А.Фроловой.- М.: Мир, 1979, 518 с.]. Результаты представляют как число розеток на 10 клеток. Индекс стимуляции рассчитывали как соотношение числа розеток в эксперименте (иммунизация ЭБ в смеси с исследуемым соединением) и числа розеток в контроле (иммунизация только ЭБ). Данные представлены в табл. 1.

Пример 3. Влияние соединения (I) на В-клеточный ответ при иммунизации слабым антигеном. Животным вводили подкожно 400 мкг БСА в 0,5 мл 0,9% NaCl. Исследуемые соединения вводили подкожно в дозе 200 мк/кг. В работе использовали 3 группы контрольных животных. Одну группу иммунизировали БСА с НПФ (1: 1 по объему), вторую - БСА с 1%-ным Аl(ОН)₃, третью - БСА без препарата. Контроль - неиммунные мыши. На 21 день аналогично проводили вторую иммунизацию (инъекционный раствор содержал 100 мкг БСА и 200 мкг исследуемого соединения). На 10-й день после второй иммунизации получали сыворотки крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по методике [Иммуноферментный анализ // Под ред. Т-Т. Иго, Г.Ленхоффа. - М: Мир, 1988]. Количественные данные приведены в табл. 2.

Пример 4. Оценка цитотоксичности соединения (I) на клетках МТ-4.

Цитотоксичность соединения (I) оценивали на культуре клеток перевиваемых Т-лимфоцитов человека (линия МТ-4). Навеску агента (I) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10 мг/мл и готовили последовательные разведения в ростовой среде, затем вносили аликвоты соответствующих разведений в лунки 96-луночных планшетов (по три на каждое разведение) при рассеве клеток до конечных концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл. Посевная концентрация составляла 0,5х10⁶ клеток/мл. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) клетки культивировали в 96-луночных планшетах для культур клеток фирмы "Costar" (США) на ростовой питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, и 5% СО₂ в течение 4 суток при 37^oС. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего. Строили дозозависимую кривую, из которой определяли цитотоксическую дозу (CD₅₀) концентрацию соединения, на 50% снижающую долю жизнеспособных клеток по сравнению с контролем. CD₅₀ для соединения (I) составляет 5,6 мкМ (табл.3).

Пример 5. Оценка анти-ВИЧ активности соединения (I) при внесении препарата после адсорбции вируса.

Анти-ВИЧ-1 активность соединения (I) изучали на высоко чувствительной к ВИЧ культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражали стоком вируса (штамм ВИЧ-1/ЭВК [Карамов Э.В., Богомолов Б.П., Жданов В.М. // Обзор центров, сотрудничающих с ВОЗ по вирусным инфекциям, 1986, 4 с.]) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубировали при 37^oС в течение 1 ч (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводили ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина до посевной концентрации 0,5х10⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Затем вносили в лунки аликвоты последовательных разведений соединения (I) в ДМСО до конечных концентраций от 0,1 нг/мл до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию). Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС и 5% СO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролировали уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. // Вопросы Вирусологии, 1992, т. 3, с. 135]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для соединения (I) составляет 0,4 мкМ. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 14. Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.3.

Пример 6. Оценка анти-ВИЧ активности соединения (I) при внесении препарата одновременно с вирусом. Анти-ВИЧ-1 активность соединения (I) изучали на культуре клеток МТ-4.

Клетки МТ-4 вносили в лунки 96-луночного культурального планшета, заражали стоком вируса (штамм ВИЧ-1/ЭВК) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, затем вносили исследуемые вещества в суспензию клеток одновременно с вирусом до конечной концентрации от 0,00001 до 1 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37^oС в течение 1 ч (адсорбция вируса). По окончании инкубации суспензию инфицированных клеток разводили полной ростовой средой со всеми добавками, как описано выше, содержащей препараты в тех же концентрациях, до посевной концентрации 0,5х10⁶ клеток/мл. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС и 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А. Г. // Вопросы Вирусологии, 1992, т. 3, с.135]. На основе полученных в эксперименте количественных данных строили дозозависимую кривую, из которой определяли ингибирующую дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% снижающую накопление вирусного антигена р24 по сравнению с контролем, которая для соединения (I) составляет 0,0026 мкМ. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 2135. Кроме того, определяли ID₉₀ - концентрацию соединения, подавляющую продукцию вируса на 90%, которая для соединения (I) составляет 0,198 мкМ, а также PD₅₀ - концентрацию соединения, на 50% защищающую инфицированные клетки от вирус-индуцированного цитопатического действия, рассчитанную, как описано нами ранее [Svinarchuk P.P., Konevetz D.A., Pliasunova O.A., Pokrovsky A.G,. Vlassov V. V.// Biochimie, 1993, Bd. 75, S. 243], которая для соединения (I) составляет 0,029 мкМ; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD₅₀ к его защищающей дозе PD₅₀, который для соединения (I) составляет 191. Количественные данные ингибирования репродукции вируса представлены в табл.4 и на фиг. 1.

Пример 7. Оценка противовирусной активности соединения (1) в отношении ВПГ-1.

Антигерпетическую активность соединения (I) изучали на чувствительных к вирусу простого герпеса культурах клеток Нер-2 и Vero с использованием ростовой питательной среды RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина. Клетки Нер-2 и Vero вносят в лунки 96-луночного культурального планшета, инкубировали при 37^oС в атмосфере 5% CO₂ - 95% воздух до формирования монослоя, заражали стоком вируса (ВПГ-1 штамм L) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку, вносили соединения в лунки планшета сразу после внесения вируса до конечной концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл (по три лунки на каждую концентрацию) и инкубировали при 37^oС в течение 1,5 ч в атмосфере 5% СО₂ - 95% воздух (адсорбция вируса). По окончании инкубации в лунки планшета вносили полную ростовую среду со всеми добавками, содержащую исследуемые соединения в тех же концентрациях, что и при адсорбции вируса. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивировали при 37^oС в 5% CO₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток путем окрашивания раствором генциан-виолета (1,3 г красителя растворяли в 50 мл 96% спирта, доводили дистиллированной водой до 700 мл и смешивали с 300 мл 40% формалина). Для этого в лунки планшета вносили по 30 мкл раствора красителя и оставляли при комнатной температуре на 1,5-2 ч. Затем трижды отмывали дистиллированной водой, планшеты высушивали, затем определяли оптическую плотность при длине волны 570 нм. На основе полученных количественных данных строили дозозависимую кривую (фиг. 2), из которой определяли эффективную дозу (ID₅₀) - концентрацию соединения, на 50% защищающую клетки от цитопатического действия вируса, которая для соединения (I) составляет 0,5 мкг/мл на клетках Нер-2. Терапевтический индекс или индекс селективности (IS), рассчитываемый как отношение цитотоксической дозы к эффективной (CD₅₀/ID₅₀), составляет для соединения (I) 40. Количественные данные противовирусной активности соединения (I) в отношении ВПГ-1 представлены в табл.5.

Таким образом, новое соединение -N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовая кислота - имеет фармакологические преимущества перед известными иммуностимулирующими и противовирусными препаратами тритерпенового ряда. Выраженное иммуностимулирующее действие сочетается с анти-ВИЧ активностью, характеризующейся высоким терапевтическим индексом (2135), а также с активностью соединения в отношении вируса герпеса 1 типа. Кроме того, соединение получают достаточно простым технологичным способом из доступного отечественного сырья - коры березы.

Изобретение относится к новому химическому веществу, конкретно к биологически активному соединению, обладающему иммуностимулирующей и противовирусной активностью (анти-ВИЧ и противогерпетической), - N'-{N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил] -9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовой кислоте формулы I. Показано, что соединение не токсично, получается из доступного сырья и обладает широким спектром противовирусной активности. Дополнительно соединение обладает выраженным иммуностимулирующим действием. 2 ил., 5 табл.

N'-{ N-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил] -9-аминононаноил} -3-амино-3-фенилпропионовая кислота формулы (I)

обладающая иммуностимулирующей и противовирусной активностью.