АМИД ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ С 5-АМИНОУРАЦИЛОМ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2003 года по МПК C07J63/00 A61K31/7068 

Предлагаемое изобретение относится к новым химическим соединениям, конкретно к амиду глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом: 3-О-{2-O-[N-(β-D-глюкуронопиранозил)-5-аминоурацил-N-(β-D-глюкуронопиранозил)-5-аминоурацил]} -(3β, 20β)-11-оксо-олеан-12-ен-30-карбоновой кислоте формулы (Iб), проявляющему анти-ВИЧ активность.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

В настоящее время во всем мире интенсивно ведутся исследования по поиску новых противовирусных средств для борьбы с такими опасными для жизни человека вирусными заболеваниями, как лихорадки Эбола, Марбурга, гепатиты В и С, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемого вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

В 1987-1988 гг. группой японских ученых была обнаружена способность глицирризиновой кислоты (ГК) - основного ингредиента экстракта корней солодки голой (Glycyrrhiza glabra) и уральской (Gl. Uralensis) ингибировать ВИЧ in vitro и in vivo [1-3]. ГК была успешно использована в условиях клиники для лечения больных СПИДом [4]. Предварительные клинические исследования показали, что при введении ГК больным СПИДом в дозе до 1,6 г в сутки увеличивается число Т4-лимфоцитов и снижается содержание вирусного антигена [4].

Механизм анти-ВИЧ действия ГК и ее производных связан со способностью потенциировать образование интерферона в плазме крови [5], а также блокированием протеинкиназы С, необходимой для связывания вируса с Т4 рецепторами [6, 7] . Установлено, что ГК непосредственно препятствует связыванию ВИЧ с клеткой. Однако, как показали наши исследования, ГК малоэффективна на модели хронической инфекции ВИЧ [8].

Задача, на решение которой направлено заявленное техническое решение, заключается в поиске новых производных ГК, обладающих анти-ВИЧ активностью. В заявленном техническом решении синтезировано новое соединение - амид ГК с 5-аминоурацилом: 3-О-{2-О-[N-(β-D-глюкуронопиранозил)-5-аминоурацил-N-(β-D-глюкуронопиранозил)-5-аминоурацил] }-(3β,20β)-11-оксо-олеан-12-ен-30-карбоновая кислота формулы (Iб), проявляющий анти-ВИЧ активность. Биологические свойства данного соединения были изучены в лаборатории ретровирусов Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор".

Синтез амида (Iб) осуществлен путем конденсации глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом в смеси диметилформамида и пиридина в присутствии дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) с выходом 56%.

Противовирусная активность препарата изучалась на традиционной модели первично инфицированных ВИЧ лимфоидных клеток МТ-4. В работе использовали штамм ВИЧ-1/ЭВК. В качестве препаратов сравнения использовали известный анти-ВИЧ препарат - ингибитор вирусной обратной транскриптазы - азидотимидин (АЗТ) в концентрации 1 мкг/мл и очищенную глицирризиновую кислоту (ГК) (95%) в концентрации 100 мкг/мл. Основным недостатком АЗТ является его высокая цитотоксичность: CD₅₀ = 3,5 мкМ [8, 9].

Цитотоксичность предлагаемого соединения (Iб) оценивали на культуре перевиваемых лимфоцитов человека линии МТ-4. Долю жизнеспособных клеток подсчитывали в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. Строили дозазависимую кривую и определяли концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток - CD₅₀.

Для оценки анти-ВИЧ активности исследуемого соединения клетки МТ-4 инфицировали штаммом ВИЧ-1/ЭВК с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. Ингибирующий эффект препарата оценивали на 4-е сутки культивирования измерением количества вирусного антигена р24 и суммарного вирусного антигена иммуноферментным методом, а также измерением активности вирусспецифического фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Кроме того, определяли степень защиты инфицированных клеток МТ-4 от гибели в результате вирусной (ВИЧ) инфекции. На основе полученных результатов строили дозазависимые кривые и определяли количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ: ID₅₀ - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 50%-ную защиту клеток; ID₉₀ - концентрацию соединения, на 90% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 90%-ную защиту клеток; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD₅₀ к его эффективной дозе ID₅₀.

Установлено, что для исследуемого препарата 50%-ная цитотоксическая доза (CD₅₀) составила 2080 мкг/мл или 1998 мкМ. Для препаратов сравнения - ГК (95% чистоты) CD₅₀ = 756 мкМ, для АЗТ - 3,5 мкМ [9].

В табл. 1 и 2 приведены результаты проведенных экспериментов по оценке анти-ВИЧ активности амида ГК с 5-аминоурацилом. Исследуемый препарат (Iб) проявляет выраженную анти-ВИЧ активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24 (87-95% в концентрации 100-800 мкг/мл) (табл. 1), ID₅₀ = 55 мкг/мл (52,8 мкМ) по данному параметру противовирусной активности (табл. 2); суммарного вирусного антигена (АГ) (ID₅₀ = 75 мкг/мл или 72,0 мкМ), снижая активность вирусной обратной транскриптазы (ревертазы) (RT) (ID₅₀ = 55 мкг/мл или 52,8 мкМ) (табл. 2), а также обеспечивая эффективную защиту клеток МТ-4 от гибели в результате вирусной инфекции (103-123% в концентрациях 50-800 мкг/мл) (табл. 1). Препараты сравнения защищают клетки МТ-4 от гибели соответственно ГК на 26%, АЗТ на 95% (табл. 1). В табл. 2 приведены количественные характеристики ингибирования ВИЧ в культуре клеток МТ-4 амидом ГК с 5-аминоурацилом (ID₉₀, ID₅₀, IS). Химиотерапевтический индекс (IS) для данного препарата по разным параметрам составил от 27,7 до 277,3, что существенно превышает таковой для ГК (от 4,4 до 24,0 для очищенного препарата) [8, 9]. Препарат практически не обладает цитотоксической активностью в исследованном диапазоне концентраций: CD₅₀ = 1998 мкМ, в то время как АЗТ почти в 540 раз токсичнее: CD₅₀ = 3,5 мкМ).

Таким образом, впервые получен амид ГК с 5-аминоурацилом формулы (Iб), проявляющий выраженную анти-ВИЧ активность в культуре клеток МТ-4, превосходящую противовирусный эффект природного гликозида - глицирризиновой кислоты, с высокой эффективностью (103-123%) защищающий клетки МТ-4 от гибели в результате ВИЧ-инфекции и обладающий низкой цитотоксичностью. Препарат почти в 540 раз менее цитотоксичен, чем известный анти-ВИЧ препарат азидотимидин (АЗТ).

Сущность технического решения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Синтез амида глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом (Iб)
К раствору 0,82 г (1 ммоль) глицирризиновой кислоты (95%) в смеси 25 мл диметилформамида и 5 мл пиридина при 0-5^oС прибавили 0,42 г (3 ммоль) 5-аминоурацила и 0,45 г (2,2 ммоль) N,N'-дициклогексилкарбодиимида и перемешивали смесь при этой температуре 1 ч, выдержали смесь с периодическим перемешиванием при 20-22^oС 24 ч. Осадок N,N'-дициклогексилмочевины отфильтровали, фильтрат разбавили холодной водой, подкислили лимонной кислотой до рН ~ 4, осадок отфильтровали, высушили и переосадили из водного диоксана. Сухой остаток перемешивали в 20 мл кислого ацетона (ацетон + НСl, рН ~2) 30 мин, отфильтровали, промыли чистым ацетоном и высушили. Выход 56%. Rf=0,4 (хлороформ-метанол-вода) (силуфол).

ИК-спектр, ν, см^-1: 3600-3200 (ОН, NH), 1720 (СООН), 1670 (С=О), 1580 (пиримидин), 1550 (CONH). УФ-спектр, λ_max, нм (lg ε): 240 (4,20); 287 (3,87). Спектр ЯМР ¹³С (ДМСО-d⁶, δ, м.д.): 88,50 (С3); 55,77 (С5); 43,22 (С8); 61,45 (С9); 36,94 (С10); 199,58 (С11); 128,52 (С12); 169,60 (С13); 50,41 (С18); 46,70 (С20); 179,28 (C30); 105,01 (С1'); 83,00 (С2'); 74,54 (C3'); 71,89 (С4'); 76,26 (С5'); 167,44 (С6'); 103,32 (С1'); 74,50 (С2''); 74,98 (C3''); 71,89 (С4''); 76,26 (С5''); 167,14 (С6''). Другие сигналы (остатки урацила): 163,16; 160,85; 160,77; 154,56; 150,00; 113,37; 113,18. Найдено, %: N 8,17. C₅₀H₆₈N₆O₁₈. Вычислено, %: N 8,07.

Пример 2. Изучение цитотоксичности и анти-ВИЧ активности амида глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом (Iб).

Цитотоксичность препарата оценивали на культуре перевиваемых лимфоцитов человека линии МТ-4. Препарат растворяли в ДМСО и в соответствующих разведениях вносили в лунки 96-луночных культуральных планшетов (по три лунки на каждое разведение) при рассеве клеток, при этом конечная концентрация ДМСО в культуральной среде не превышала 1%. Посевная концентрация составляла 5•10⁵ клеток/мл. Далее клетки культивировали на ростовой среде (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина) при 37^oС и 5% углекислого газа в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. Строили дозазависимую кривую и определяли концентрацию соединения, вызывающую гибель 50% клеток - CD₅₀.

Установлено, что для амида (Iб) 50%-ная цитотоксическая доза (CD₅₀) составила 2080 мкг/мл или 1998 мкМ, в то время как для ГК CD₅₀ = 756 мкМ, для АЗТ 3,5 мкМ [8, 9]. Таким образом, предлагаемое соединение (Iб) является менее токсичным веществом для клеток иммунной системы МТ-4, чем препараты сравнения.

Для оценки анти-ВИЧ активности исследуемого соединения клетки МТ-4 инфицировали штаммом ВИЧ-1/ЭВК с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37^oС инфицированные и контрольные клетки разводили ростовой средой до посевной концентрации 5•10⁵ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Затем вносили растворы исследуемого соединения (по три лунки на каждое разведение) и далее культивировали как описано выше. Конечная концентрация препарата в культуральной среде составляла от 0,001 до 20 мкг/мл.

Ингибирующий эффект препарата оценивали на 4-е сутки культивирования измерением количества вирусного антигена р24 и суммарного вирусного антигена иммуноферментным методом, а также измерением активности вирусспецифического фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Кроме того, определяли анти-ВИЧ активность, исходя из степени защиты инфицированных клеток от гибели в результате вирусной инфекции, подсчитывая долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания трипановым синим. На основе полученных результатов строили дозазависимые кривые и определяли количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ: ID₅₀ - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 50%-ную защиту клеток; ID₉₀ - концентрацию соединения, на 90% подавляющую продукцию вируса или обеспечивающую 90%-ную защиту клеток; IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы соединения CD₅₀ к его эффективной дозе ID₅₀. В качестве препаратов сравнения использовали очищенную глицирризиновую кислоту (95%) (ГК) и известное анти-ВИЧ средство - азидотимидин (АЗТ).

В табл. 1 и 2 приведены результаты проведенных экспериментов по оценке анти-ВИЧ активности амида глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом. Показано, что исследуемый препарат проявляет выраженную анти-ВИЧ активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24 (ID₅₀ = 55 мкг/мл или 52,8 мкМ), суммарного вирусного антигена (ID₅₀ = 75 мкг/мл или 72,0 мкМ), снижая активность обратной транскриптазы (ревертазы) (RT) (ID₅₀ = 55 мкг/мл или 52,8 мкМ) (табл. 2), а также обеспечивая эффективную защиту клеток МТ-4 от гибели (102-123%) (табл. 1) в результате вирусной инфекции. Количественные характеристики ингибирования ВИЧ в культуре клеток МТ-4 амидом ГК с 5-аминоурацилом (Iб) (ID₅₀, ID₉₀, IS) приведены в табл. 2. Химиотерапевтический индекс (IS) для данного препарата по разным параметрам составил от 27,7 до 277,3, что существенно превышает таковой для очищенной ГК (4,4 - 24,0) [9].

Источники информации
1. M.Ito, A.Sato, K.Hirabayashi, F.Tanabe, Sh.Shigeta, M.Baba, E.De Clerq, H.Nakashima, N.Yamamoto. Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin on replication of human immunodeficiency virus (HIV). //Antiviral Res., 1988, v.10, N 6, p.289-298.

2. M.Ito, H.Nakashima, M.Baba, R.Puwels, E.De Clercq, Sh.Shigeta, N.Yamamoto. Inhibitory effect of glycyrrhizin on the in vitro infectivity and cytopathic activity of the human immunodeficiency virus [HIV (HTLV-III/LAV)] . //Antiviral Res., 1987, v.7, N 3, p.l27-137.

3. M.Ito, H.Nakashima, N.Yamamoto. Glycyrrhizin and its salts for inhibiting growth of virus of acquied immune deficiency syndrom (AIDS). //Eur. Pat. 255420, 1988. //Chem. Abstr, v.l09, 116062v.

4. M.Ito. Clinical effects of glycyrrhizin on human immunodeficiency virus disease. //Jikken Igaku, 1989, v.7, N 7, p.858-860. //Chem. Abstr, v. 111, R49739x.

5. Y.Feng, T.Zhu. Effect of glycyrrhizin on the production of γ-interferon (IFN) from human spleen cells. //Zhonghuo Weish Cngutuxue He Hianyxue Zazhi, 1986, v.6, N 2, p.99-102. //Chem. Abstr., v.l05, 18041k.

6. T. S.Tochikara, H.Nakashima, Y.Yamamoto. Antiviral agents with activity against human retroviruses. //J. Acquied Immune Def. Syndrome, 1989, N 2, р.441-447.

7. Г. А. Толстиков, Л.А.Балтина, Э.Э.Шульц, А.Г.Покровский. Глицирризиновая кислота. //Биоорган. химия, 1997, т.23, 9, с.691-709.

8. О. А. Плясунова. Скрининг и изучение препаратов - ингибиторов вируса иммунодефицита человека. Дисс. канд. биол. наук в форме научного докл. Кольцово, 1992, 55 с.

9. О.А.Плясунова, И.Н.Егоричева, Н.В.Федюк, А.Г.Покровский, Л.А.Балтина, Ю. И. Муринов, Г.А.Толстиков. Изучение анти-ВИЧ активности β-глицирризиновой кислоты. //Вопросы вирусологии, 1992, 5-6, с.235-238.

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к амиду глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом формулы I, проявляющему анти-ВИЧ активность, в культуре клеток МТ-4, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусспецифического белка р24 (ID₅₀ = 55 мкг/мл или 52,8 мкМ), суммарного вирусного антигена (ID₅₀ = 75 мкг/мл или 72,0 мкМ), что снижает активность обратной транскриптазы (ревертазы) (RT) (ID₅₀ = 55 мкг/мл или 52,8 мкМ). Химиотерапевтический индекс (IS) данного соединения по разным параметрам составил 27,7-277,3, что существенно превышает таковой для ГК (4,4-24,0) и обеспечивает эффективную защиту клеток МТ-4 от гибели (102-123%) в результате ВИЧ-инфекции. Защитный эффект превосходит защитное действие глицирризиновой кислоты (ГК) и азидотимидина. В отличие от последнего амид ГК с 5-аминоурацилом ~ в 540 раз менее токсичен для клеток (CD₅₀ = 2080 мкг/мл или 1998 мкМ). 2 табл.

Амид глицирризиновой кислоты с 5-аминоурацилом формулы (I) (см. графическую часть)
проявляющий анти-ВИЧ активность.