Способ получения L-лизин- @ -оксидазы Советский патент 1989 года по МПК C12N1/14 C12N9/06 

1

Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и научных исследованиях.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Способ заключается в следующем.

После культивирования Trichoder- гла hazzianum Rifai отделяют -культу- ральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммония- (35% насыщения), центрифугируют и проводят хроматографию на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а затем диализованные фракции фермента

10

15

наносят на колонку с аффинным сорбентом лизин-сефарозой CL4B и злюи- руют фермент линейным градиентом хлористого натрия от О до 1 м, причем обе хроматографии проводятся при рН 5,5-7,4, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммония.

Использованный бутилсилохромовый сорбент содержит в качестве специфических лигандов бутиловые радикалы, обеспечивающие специфическое гидрофобное взаимодействие их с лизинокси- дазой.

L-Лизин-сефароза CL4B относится к биоспецифическому сорбенту по отношению к ферменту.

4 СП

4

СЮ 4

О5

Сорбенты с выбранными структурами обладают необходимыми свойствами, которые позволяют достичь поставленную цель, т.е. освободиться от сопутству- ющих ферменту примесей и получить его с 56,0%-ным выходом.

Пример 1. Способ получения высокоочищенной L-лизин- ct -оксидазы

Получение сорбента бутштеилохро- ма 500/80.

Получение бутилглицидилового эфира.

В колбу вместимостью 1 л, снабженную механической мешалкой, термометром, капельной воронкой и обратным холодильником, вводят 456,8 мл н-бутанола и 20 мл BF (. Температуру смеси поднимают до и при перемешивании вводят по каплям в течение 4 ч 395 мл эпихлорпздрина. Смесь оставляют на 14 ч, после гего при перемешивании при 20-25 С вводят по каплям 250 мл 50%-ного раствора NaOH. Выделившийся эфир отделяют, промывают четырьмя порциями дистиллированной воды и продукт высушивают над безводным N§864. Эфир фильтруют и перегоняют в вакууме при 57-63 С/ /19 мм рт. ст.

Получение бутилсилохрома 500/80, В колбу вместимостью 500 мл, снабженную механической мешалкой, тгрмо- метром и обратным холодильником, вносят 100 г силохрома эпоксидного 500/80 (ТУ 6-09-10-1618-84), добавляют 350 мл абсолютного диоксана, 10 мл бутилглицидилового эфира и при перемешивании .суспензии вводят ho каллям 7 мл бора трехфтористого эфирата. Суспензию перемешивают в течение 5-10 мин при комнатной температуре, после чего температуру подниь1ают до 90 С и смесь перемеши- вают 2 ч при 9О°С. Полученный оорбент отфильтровывают, промывают диок саном, этанолом, дистиллированной водой, ацетоном и высушивают при 60-7О с в течение 24 ч. Концентраци остатков бутила в сорбенте составляет 80 мкмоль/г.

Получение сорбента лизин-сефарозы CL4B.

28 мл сефаро ы СЬ4Б заливают .: , 26,4 мл 1 М натриевой щелочи и вводят при перемешивании по каплям в течение 15 мин 5,6 мл эпихлоргидрин Суспензию перемешивают еще 1 ч при комнатной температуре и 1 ч при 60

5

0

5

Затем отмывают 6 раз чередованием . по 30 мл водой и этанолом. После чего эпоксидированную сефарозу заливают раствором, полученным следующим образом.,3,1 г хлоргидрата лизипа растворяют в 20 мл дистиллированпой воды, прибавляют 9,3 г основной углекислой меди, перемешивают 15 мин при 80 С, фильтруют и осадок промывают 5 мл дистиллированной воды, рН фильтрата доводят до 9,9, добавляют карбонат натрия до концентрации 1 М. Полученную суспензию перемешивают А ч при 80 С, фильтруют и осадок промывают последовательно 400 мл дистиллированной воды, 500 мл 0,1 М ЭДТА, 300 мл воды, 500 мл О, 1 М карбонатом натрия и 400 мл. воды.

Получение бесклеточной культураль- ной жидкости, содержащей L-лизин- ; - .-оксидазу.

Продуцент лизшшксидазы Tricho- (derma hazzianum Rifai культивируют глубинным способом на питательной среде следующего состава, г/л: 50 пшеничных отрубей и 50 , при 28 С на качалке в течение 6 сут. Клетки микроорганизмов и твердые 0 осадки отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 0,5 ч. В центрифугате определяют удельную L-лизHH-t -оксидазную активность, котора.я составляет 1,07 Е/мг белка

(1170 мл).

Осаждение примесе й аммоний сульфатом.

В бесклеточную культуральную жидкость в объеме 1170 мл (рН 7,1) с удельной активностью 1,28 Е/мг белка при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 мин добавляют аммоний сульфат марки х.ч. (244,5 г) до 35% насыщения. Перемешивание про- должают еще 1 ч,, затем выпавший осаг док центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 ч. Осадок отбрасывают, а супернатант объемом 1250 мл (содер- -жание белка 2012 мг, лизиноксидазная активность 2585 ед) наносят на колонку с сорбентом бутилсилохром 500/80.

Хроматография ферментного раствора на сорбенте бутилсилохром 500/80.

Хроматографию проводят при 4 С. Стеклянную колонку размером 50x70 мм заполняют 100 г бутилсилохрома (конц. лиганда 80 мкМ/г), уравновешивают тремя объемами (350 мл) 0,02 М натрий фосфатного буфера (рН 6,6). За35

40

50

55

тем наносят на так нодготовленную , колонку с сорбентом со скоростью 200 мл/ч с помощью перистальтического насоса 1250 мл ферментного раствора Е 1 М аммоннй сульфате (35% насыщения).

Колонку промывают 420 мп 1 М раствора аммоний сульфата в.0,02 М натрий фосфатном буфере в течение 7 ч (скорость тока 50 мл/ч). При этом отмываются , которые отбрасывают. Затем переключают насос на исходный Oj02 М натрий фосфатный буфер и элюированне продолжают со скоростью 25 мл/ч. Порцию элюата объемом 130 мл, не обладающего ферментативной активностью, отбрасывают, а последующие .фракции объемом 240 мл собирают, определяют лизиноксидазную активность и белок, которые равны 1913 ед. и 218 мг соответственно, что отвечает удельной активности 8,77 Е/мг белка, выход по активности .на этой стадии 74%.

Диализ. ,

Элюат объемом 240 мл (уд. акт. 8,77 Е/мг) диализируют против 0,01 М универсального буфера (УБ), состоящего из равных по объему 0,01 М уксусной, борной и ОрТОфОСфОрНОЙ JCHCnOT

(рН 7,4), при 4 С в течение 20 ч и наносят на L-лизин-сефарозу СЬ4Б, уравновешенную 0,02 М универсальным буфером, рН 7,4.

Хроматография ферментного раствора на сорбенте Ь-лизин-сефарозе СЪЛВ.

Хроматографию проводят при 4 С. Стеклянную колонку размером 25x140мм

обладающего лизиноксидазнсй ферментативной активностью, отбрасывают, а последующий элюат в количестве 72 мл собирают, определяют L-лизин-с(-окси- дазную активность и содержание белка, насыщают до 35% аммоний сульфатом н хранят. Удельная лизиноксндазная активность составляет 27,0 Е/мг, выход 10 по активности на этой стадни хроматографии равен 95%. Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру I составляет 51.8%. Пример 2. Способ получения 15 высокоочищенной L-лизин-о(-оксидазы проводят аналогично примеру 1, только хроматографию L-лизин- -оксидазы на сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 7,4. Получают фермент с вы- 20 ходом 56,0%, с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.

Пример 3. Способ получения высокоочищенной Ъ-лизин-(( -оксидазы проводят аналогично примеру 1, толь- 25 ко хроматографию L-лизин-(.-оксидазы на сорбенте бутилсилрхроме проводят при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2%, с удельной активностью 26,5 Е/мг белка.

30

Формула

3 о б р е тен и я

35

Способ получения L-лизин-« -оксидазы из культуральной жидкости гриба Trichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента сульфатом аммония с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых

Стеклянную колонку ра.м..и........ . последующим осажде- заполняют 100 мл (25 г сухого вещест ц i -, .,ятпм аммония.

ва) набухшего сорбента L-лизин-сефа- розы CL4B уравновешивают 200 мл 0,01 М унив-ерсального буфера, рН 6,6. Затем наносят на так подготовленную колонку со скоростью 24 мл/ч 240 мл 5 диализата (210 мг белка, 2034 ед. лизиноксидазной активности). Исходным буфером (тот ме уравновешиваюпщй) объемом 420 мл со скоростью 24 мл/ч вымы. примеси- и отбрасывают. За- gg тем исходный буфер заменяют на гра- .диент равных по объему(исходньй бут- фер - 1 М раствор натрия хлористого) и элюирование продолжают с той же скоростью. Порцию 120 мл элюата, не

кием последнего сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода целевого продукта и упрощения способа, на пер вом этапе хроматографию проводят на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором - ведут аффинную хромато графию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах рН устанавливают 5,5- 7,4, при этом перед проведением аф-: финной хроматографии осуществляют дополнительную очистку элюата диализом, а осаждение после аффинной хроматографии проводят сульфатом аммония 35% насыщения.

T

54846

обладающего лизиноксидазнсй ферментативной активностью, отбрасывают, а последующий элюат в количестве 72 мл собирают, определяют L-лизин-с(-окси- дазную активность и содержание белка, насыщают до 35% аммоний сульфатом н хранят. Удельная лизиноксндазная активность составляет 27,0 Е/мг, выход 10 по активности на этой стадни хроматографии равен 95%. Общий выход от начальной активности в культуральной среде по примеру I составляет 51.8%. Пример 2. Способ получения 15 высокоочищенной L-лизин-о(-оксидазы проводят аналогично примеру 1, только хроматографию L-лизин- -оксидазы на сорбенте бутилсилохроме проводят при рН 7,4. Получают фермент с вы- 20 ходом 56,0%, с удельной активностью целевого продукта 31,5 Е/мг белка.

Пример 3. Способ получения высокоочищенной Ъ-лизин-(( -оксидазы проводят аналогично примеру 1, толь- 25 ко хроматографию L-лизин-(.-оксидазы на сорбенте бутилсилрхроме проводят при рН 5,5. Получают фермент с выходом 49,2%, с удельной активностью 26,5 Е/мг белка.

30

Формула

3 о б р е тен и я

Способ получения L-лизин-« -оксиазы из культуральной жидкости гриба Trichoderma hazzianum Rifai, включающий осаждение примесей фермента сульфатом аммония с последующим проведением двухэтапной очистки путем хроматографии с получением целевых

. последующим осажде- i -, .,ятпм аммония.

. последующим осажде- i -, .,ятпм аммония.

кием последнего сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода целевого продукта и упрощения способа, на первом этапе хроматографию проводят на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме, а на втором - ведут аффинную хроматографию на лизин-сефарозе CL4B и на обоих этапах рН устанавливают 5,5- 7,4, при этом перед проведением аф-: финной хроматографии осуществляют дополнительную очистку элюата диализом, а осаждение после аффинной хроматографии проводят сульфатом аммония 35% насыщения.

Изобретение относится к препаративной энзимологии и касается выделения высокоочищенного фермента и может быть использовано в медицине и науч- . ных исследованиях. Целью изобретения является повьшение выхода целевого продукта и упрощение способа. Способ заключается в следующем. После культивирования Trichodermai hazzia- num Rifai отделяют культуральную жидкость центрифугированием, осаждают примеси сульфатом аммония (35% насыщения) , центрифугируют и проводят хроматографии на гидрофобном сорбенте бутилсилохроме и аффинном сорбенте лизин-сефарозе СЬ4Б, а полученный ферментный раствор насыщают сульфатом аммония i с (О