СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ ПРЕЦИПИТАЦИИ ГРАНУЛ БИЛИРУБИНАТА КАЛЬЦИЯ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и может быть использовано при исследованиях физико-химических свойств нативной желчи.

Известны различные способы исследования физико-химических свойств желчи, таких как: определение индекса насыщения холестерином нативной желчи (J. Lipid. Res. 1978, v. 19 p. 945-955), определение времени нуклеации и преципитации кристаллов моногидрата холестерина в нативной желчи ин витро (Gastroenterology, 1979, v. 77, р. 611-17), определение потенциальной нуклеирующей способности желчи (Clin. Chim. Acta 1987, 165, р. 295-302).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ регистрации преципитации гранул билирубината кальция в нативной желчи.

Известный способ осуществляют следующим образом.

Пузырную желчь получают при холецистэктомии. Желчь аспирируют из желчного пузыря и хранят в стерильных пластиковых пробирках в темноте при Т= +37^оС с полностью удаленным воздухом. В течение первого часа после сбора желчи, ее пробы центрифугируют 2 ч при 100.000 g, свободный от кристаллов слой изолируют и хранят в стеклянных трубках с тефлоновыми пробками в среде азота. Образец исследуют на отсутствие кристаллов моногидрата холестерина или других частиц. Затем с помощью обычной и поляризационной микроскопии образцы ежедневно исследуют на появление кристаллов моногидрата холестерина, билирубината кальция и жидких лецитин холестериновых кристаллов. Появление кристаллов моногидрата холестерина является конечной точкой определения времени нуклеации. При отсутствии кристаллов исследование заканчивают на 21 день.

Недостатком этого способа является невысокая точность определения преципитации гранул билирубината кальция.

Целью предлагаемого технического решения является повышение точности способа за счет установления окончания процесса преципитации.

Способ осуществляют следующим образом.

Образец нативной желчи центрифугируют при 25.000 g в течение 60 мин и отделяют изотропную фазу желчи (маточный раствор) от преципитата. Маточный раствор изотропной фазы желчи помещают в темные стеклянные емкости и инкубируют в термостате при Т=+37^оС. Для подтверждения изотропности центрифугата проводят анализ фазоконтрастной микроскопии. Аликвоту изотропной желчи разводят бидистиллированной водой и измеряют величину ее оптической плотности в УФ-спектре при λ_мах=453 нм. Исследования проводят ежедневно в течение 21 дня, используя каждый раз новую аликвоту маточной пробы желчи.

Снижение величины оптической плотности до 0,2-0,1 характеризует завершения процесса преципитации гранул билирубината кальция.

Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Обследуемый К., 23 лет, ист. болезни N 803-206, поступил на плановое обследование. При поступлении жалоб не предъявлял.

Результаты обследования: общий анализ крови - эр. 4,53 ^. 10¹², гемоглобин - 144, цвет. показатель - 0,9, лейкоциты при поступлении - 2,3 ^. 10⁹; при выписке - 4,6 ^. 10⁰, п-2, с-66, м-1, э^-1, л^-30, СОЭ - 5 мм/час. Морфологических изменений в форменных элементах крови не выявлено. Анализ мочи в норме. Биохимические анализы крови без отклонений от нормы. Данные холецистографии - концентрационная и сократительная функции желчного пузыря не нарушены. Рентгеноскопия желудка и 12-перстной кишки - органической патологии не выявлено. При обследовании проведено дуоденальное зондирование: пузырная порция "В" - рН - 7,5; цвет коричневый, прозрачная, соли желчных кислот в небольшом количестве. Печеночная порция "С" - рН -7; цвет золотисто/желтый, соли желчных кислот в небольшом количестве. Спектроскопическому исследованию подвергнута порция "В".

Образец нативной желчи центрифугировали при 25.000 g в течение 60 мин и отделяли изотропную фазу желчи (маточный раствор) от преципитата. Маточный раствор изотропной фазы желчи помещали в темные стеклянные емкости и инкубировали в термостате при Т=+37^оС. Для подтверждения изотропности центрифугата проводили анализ фазо-контрастной микроскопиии. Аликвоту изотропной фазы желчи разводили бидистиллированной водой и измеряли величину оптической плотности данной аликоты в УФ-спектре при λ_мах=453 нм.

Для получения УФ-спектров использовался спектрофотометр "Specord UV-VIS" (ГДР). Толщина кювет 1,0 см. УФ-спектр регистрировался в оптимальном режиме: не ниже 0,3 и не выше 1,0 единиц оптической плотности. Было зарегистрировано снижение величины оптической плотности с 0,5 до 0,2 в течение 18 дней. 1-й день - 0,5; 2-й - 0,5; 3-й - 0,48; 5-й - 0,47; 6-й - 0,46, 7-й - 0,43; 84-й - 0,42; 9-й - 0,40. 10-й - 0,38; 11-й -0,36;12-й - 0,34; 13-й - 0,32; 14-й - 0,30; 15-й - 0,28; 16-й - 0,24; 17-й - 0,21; 18-й - 0,2. Данные фазо-контрастной микроскопии показали увеличение количества гранул билирубината кальция с 6-10 до 30-40 в поле зрения. Дальнейшее исследование аликвот не выявило снижение величины оптической плотности и увеличение количества гранул билирубината кальция. Следовательно, был сделан вывод о завершении процесса преципитации гранул билирубината кальция.

Полученные данные клинико-лабораторных исследований позволили установить диагноз - практически здоров. Со стороны билиарной системы патологии не выявлено.

П р и м е р 2. Больная П., 37 лет, ист-я болезни N 1054/433 поступила в клинику с жалобами на ноющие боли в правом подреберье, чаше появляющиеся после еды, тошноту, снижение аппетита, апатию, слабость.

Диагноз при поступлении - хронический холецистит.

Данные обследования: общий анализ крови мочи без отклонений от нормы. Биохимические анализы крови: холестерин - 5,2, ммоль/л; билирубин - 17,5 мкмоль/ АСТ - 0,44; АЛТ - 0,47; СРБ - 0; сахар крови - 4,2. Дуоденальное зондирование: пузырная порция желчи "В" - 60,0, цвет оливковый, щелочная, лейкоциты в редких полях зрения. По данным холецистографии калькулезный холецистит. УЗС - стенка желчного пузыря плотная, утолщена, в просвете 2 конкремента 2,5х1,0 и 3,0х0,8 см.

Клинический диагноз - калькулезный холецистит.

Больной проведена холецистектомия. Пузырная желчь и желчные камни были получены при холецистектомии.

Данные УФ-спектроскопии пузырной желчи показали снижение величины оптической плотности с 0,9 до 0,1 при max=453 нм в течение 5 дней: 1-й день - 0,9; 2-й день - 0,7; 3-й - 0,4; 4-й - 0,2; 5-й - 0,1. Фазо-контрастная микроскопия зарегистрировала увеличение гранул билирубината кальция с 20-30 до 400-500 в поле зрения. Дальнейшего снижения величины оптической плотности, при одновременном увеличении гранул билирубината кальция, не происходило. ИК-спектроскопическое исследование желчного камня показало, что содержание в нем билирубината кальция составило 20%.

Авторами установлено достоверное отличие времени окончательной преципитации гранул билирубината кальция у здоровых и больных. Так, время преципитации гранул билирубината кальция у здоровых лиц (контрольная группа) составило от 12 до 18 дней, а у больных хроническим калькулезным холециститом - от 3-х до 7 дней. Величина оптической плотности при этом изменялась с 0,4±0,1 и с 1,1±0,1, соответственно. Полученные данные отражены в нижеприведенной таблице.

Таким образом, предложенный способ позволяет точно установить окончание процесса преципитации гранул билирубината кальция, проследить его динамику, а по интенсивности процесса преципитации - формировать группы больных, предрасположенных к пигментному холелитиазу.

Использование: медицина. Сущность изобретения: определяют время преципитации гранул билирубината кальция путем взятия пробы желчи, центрифугирования аликвоты при 25.000 g в течение 60 мин, растворения в бидистиллированной воде и измерение величины оптической плотности в УФ-спектре при λ_max= 453 нм Окончание процесса преципитации гранул билирубината кальция устанавливают по снижению оптической плотности до 02 - 01 единиц. Способ позволяет выявить предрасположенность к пигментному холелитиазу.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ ПРЕЦИПИТАЦИИ ГРАНУЛ БИЛИРУБИНАТА КАЛЬЦИЯ путем центрифугирования и инкубации пробы с последующей регистрацией, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, пробы желчи центрифугируют при 25000 g в течение 60 мин, супернатант разводят бидистиллированной водой, а время преципитации билирубината кальция регистрируют спектрофотометрически при снижении оптической плотности полученного раствора до 0,2 - 0,1 единиц.