СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРАНСПОРТА АЛЬБУМИНА ИЗ ПОЛОСТЕЙ ТЕЛА В ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО Российский патент 1994 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для количественной оценки и визуализации на клеточном и субклеточном уровнях транспорта антигенов из полостей тела.

В экспериментальной медицине известны различные способы определения транспорта веществ из полостей тела, такие как определение путей транспорта веществ из полостей тела с помощью туши (Brierley J.B., Field E.J. J. Anat. , 1948, v. 82, P. 153-166), ферритина, угля (Fedorko M.E., Hirsch J.G., Fried B. Exp. Cell. Res., 1971, v. 69, P. 313). Также известен способ определения транспорта белков путем их метки пероксидазой хрена (Mikhaylova K., Vasilev V. Histochemistry, 1988, v. 88, N 3-6, P. 583-586).

Наиболее близким к предлагаемому является способ количественной оценки транспорта альбумина из полостей тела в лимфатические узлы у экспериментального животного с использованием метки радиоактивным изотопом (Widner H., Jonsson B-A. , Hallstadius L. et al. Eur. J. Nucl. Med., 1987, v. 13, N 9, P. 456-461).

Известный способ осуществляют следующим образом. В желудочек мозга крысы вводят альбумин, меченый радиоактивным изотопом 99Тс, и с помощью сцинтилляционной камеры измеряют изменение радиоактивности головы и шеи животного в течение 70 мин. Получаемая динамика радиоактивности позволяет судить о количестве транспортируемого антигена в исследуемой области. Через 10 ч животное забивают, и исследуют уровень радиоактивности в тканях, то-есть определяют количество поступившего маркера. На ультраструктурном уровне накопление метки оценивают методом количественной авторадиографии.

Данный способ имеет ряд существенных недостатков. Прежде всего это наличие опасного радиоактивного излучения. Обращение с такими реактивами требует специального оборудования, соблюдения определенных мер безопасности. Кроме того, для выявления маркера на клеточном и субклеточном уровнях (методом авторадиографии) необходимо выполнение сложной многоступенчатой методики с наслаиванием фоточувствительной эмульсии, ее проявлением и т.п.

Целью изобретения является исключение лучевого воздействия на организм и упрощение визуализации метки на морфологическом препарате.

Отличительные признаки изобретения заключаются в том, что в качестве маркера альбумина используют коллоидное золото с размером частиц 10 нм, взятых в соотношении альбумин : коллоидное золото 12,5 : 1.

Также отличие заключается и в том, что количество накапливаемого антигена определяют по интенсивности возбуждения атомов золота под воздействием синхронного излучения и морфометрически.

Способ осуществляют следующим образом.

Перед введением в полость тела исследуемый антиген-альбумин метят коллоидным золотом, представленным монодисперсной взвесью частиц с контролируемым размером, в соотношении 12,5 : 1.

Меченый белок после введения в полость тела, распознается, транспортируется, поглощается клетками в соответствии с его антигенными свойствами. Путем последующего морфологического исследования на световом и ультраструктурном уровне выявляют расположение метки, а соответственно, и искомого антигена.

Количественную оценку транспорта и утилизации антигена проводят морфометрическим подсчетом частиц коллоидного золота, находящихся в клетках лимфоузла. Кроме того, по интенсивности возбуждение золота под воздействием синхротронного излучения проводят количественную оценку транспорта антигенов на органном уровне.

Предложенный способ поясняется примером.

Проводилось количественное определение транспорта альбумина, меченого коллоидным золотом, из брюшной полости кроликов в медиастинальные лимфоузлы.

Коллоидное золото получают восстановлением кипящего раствора 0,001% HAuCl₄ (80 мл) с 4% цитратом натрия (20 мл) в течение 15 мин. Готовый раствор содержит частицы золота размером 10 нм. К суспензии коллоидного золота альбумин добавляют в концентрации в 100 раз более высокой, чем точка флокуляции, определяемая реакцией Жигмонди. От несвязавшегося белка коллоид освобождают центрифугированием при 10000 G в течение часа. Чистый супернатант удаляют и темно-красный центрифугат ресуспендируют в остаточном супернатанте.

Исследование выполняли на 6 кроликах массой от 2,8 до 3,1 кг. Коньюгат в объеме 10 мл вводили в брюшную полость через небольшой разрез брюшной стенки под внутривенным гексеналовым наркозом. На каждое животное было израсходовано 2 мг HAuCl₄, связанного с 25 мг человеческого альбумина (в соотношении 1 : 12,5). Животные были забиты на сроках 0, 5, 2, 4, 6, 12, 24 ч от момента введения. Медиастинальные лимфоузлы удаляли, фиксировали 4 ч в 4% парафромальдегиде и 1 ч в OsO₄, заливали в эпон-аралдит. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым голубым и исследовали на световом микроскопе. Тонкие срезы, после окраски цитратом свинца и уранил ацетатом, исследовали на электронном микроскопе Филлипс ЕМ-410.

При исследовании неокрашенных полутонких срезов лимфоузлов на сроке 2 ч от момента введения коньюгата было обнаружено наличие в срезе темных точек. При окраске толуидиновым синим установлено, что эти точки соответствуют вторичным лизосомам, наполненным коньюгатом. Ретикулярные клетки, протягивающиеся через просвет краевого, бокового и медуллярного синусов, содержат большое количество частиц коллоидного золота. Также большое количество маркера содержали ретикулярные клетки, выстилающие лимфатические фолликулы и кровеносные сосуды в синусе. Комплексы альбумин-коллоидное золото располагались на поверхности, внутри везикул и во вторичных лизосомах ретикулярных клеток. Синусоидальные макрофаги несли большое число поверхностно связанных частиц. В кровеносных сосудах, пересекающих синусы лимфоузла, маркер был найден только в ретикулярных клетках, образующих внешний слой сосуда. В лимфатических фолликулах метка не обнаружена.

Случайным наложением морфометрической решетки по Автандилову оценивалось распределение количества антигена по зонам лимфатического узла. При этом обнаружено, что субкапсулярный синус содержит 17,5 ± 3,2% антигена захваченного лимфатическим узлом, клетки промежуточных синусов содержат 38,3 ± 2,1%, а клетки синусов мозгового вещества - 44,2 ± 3,1 % антигена. Между клеточными элементами лимфатического узла антиген распределился следующим образом: ретикулярные клетки, пересекающие синус, содержали 64,2 ± 4,5% , клетки, выстилающие лимфатические фолликулы - 21,5 ± 2,8%, адвентициальные ретикулярные клетки -11,3 ± 2,1%, блуждающие макрофаги -3 ± 0,9%.

Количественный электронно-микроскопический анализ показал, что через 2 ч после внутрибрюшинного введения альбумина в ретикулярных клетках 5,2 ± 0,8% частиц располагались на отдельных рецепторах поверхностной мембраны, 9,4 ± 0,7% в виде скоплений антигена (кэппинг), 12,2 ± 1,8% в транспортных везикулах и 73,2 ± 4,2% во вторичных лизосомах.

Количественная оценка транспорта антигена при помощи синхронного излучения проводилась на удаленных медиастинальных лимфоузлах. Для этого лимфоузел подвергали воздействию излучения синхрофазотрона и регистрировали возбуждение атомов золота, по интенсивности которого судили о количестве маркера захваченного лимфоузлом. Определено, что через 0,5 ч после внутрибрюшинного введения в медиастинальном лимфоузле накапливалось 0,021 ± 0,001 мг золота, через 2 ч - 0,025 ± 0,002 мг, через 4 ч - 0,082 ± 0,005 мг, через 6 ч - 0,061 ± 0,003 мг, через 12 ч - 0,033 ± 0,001 мг и через 24 ч - 0,002 ± 0,001 мг золота. При этом максимальная концентрация золота обнаруживалась по периферии узла в виде кольцеобразной структуры.

Приведенный пример показал, что использование в качестве маркера антигена коллоидного золота позволяет дать полную количественную оценку транспорта антигена из брюшной полости. С помощью синхротронного излучения определена динамика накопления маркера медиастинальным лимфоузлом. При световой микроскопии дан количественный анализ распределения метки по зонам лимфоузла и ультраструктурным исследованием определено распределение метки по органеллам ретикулярной клетки лимфоузла.

Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить количественную оценку транспорта белков из полостей тела животного (брюшной, плевральной, перикардиальной, полостей мозга и т.д.). Количественный анализ возможен на уровнях от органного до субклеточного. При этом визуализация маркированного антигена на морфологическом препарате, в отличие от способа с применением радиоактивной метки или пероксидазы, не требует выполнения специальных методик.

Способ оценки транспорта альбумина из полостей тела в лимфатические узлы у экспериментального животного. Использование: в области экспериментальной медицины, а именно в морфологии. Цель изобретения - исключение лучевого воздействия и упрощение визуализации метки. Сущность изобретения: в полость тела животного вводят меченый антиген с последующим определением его на морфологическом препарате. При этом в качестве метки антигена используют коллоидное золото с размером частиц 10 нм, взятых в соотношении альбумин: коллоидное золото 12,5 : 1, а количество антигена определяют морфометрически и по интенсивности возбуждения атомов золота под воздействием синхротронного излучения. Способ прост в исполнении и исключает лучевое воздействие.

СПОСОБ ОЦЕНКИ ТРАНСПОРТА АЛЬБУМИНА ИЗ ПОЛОСТЕЙ ТЕЛА В ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО путем введения в полость меченого альбумина с последующим определением его на морфологическом препарате, приготовленном из ткани лимфатического узла, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве маркера альбумина используют коллоидное золото с размером частиц 10 нм, взятых в соотношении альбумин: коллоидное золото 12,5 : 1, а определение количества транспортируемого альбумина в лимфатические узлы проводят морфологически и по интенсивности возбуждения атомов золото под воздействием синхротронного излучения.