Способ получения растений-регенерантов НоRDеUм VULGaRe, устойчивых к токсическому действию AI @ в кислой среде Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции растений для повышения эффективности селекционного процесса.

Проблема устойчивости зерновых злаков, прежде всего ячменя, к токсичности кислых почв является одной из крупнейших в сельском хозяйстве мира (Бразилия, Канада, США, Япония и другие страны). Сущность проблемы состоит в том, что в условиях повышенной кислотности (рН водного раствора 5,5 до 3,0) алюминий, который обычно находится в почве в виде нерастворимых солей, переходит в раствор с образованием катиона А13+и оказывается сильно токсичным для растений, резко снижая их урожайность. В полной мере это относится и к СССР,

где свыше 50% полевых земель расположены в Нечерноземной зоне, почаы которой имеют кислую реакцию.

Цель изобретения - увеличение выхода устойчивых растений.

Способ состоит в том, что незрегие зародыши ячменя культивируют на соеде. включающей (в мг/л) минеральные соли по Мурасигеи Скугу, сахарозу 20000 0000, тиамин 1,0-10,0, миоинозитол 80-100, пиридоксин 0,5-1,° никотиновую кислоту 0,5-1,0, 2,АД (для формирования каллуса) 2,0-3,0 или АНУ и кинетин (для регенерации растений) по 0,Ь- 1,0, агар-агар 6000-7000, а также мг/л алюминия в виде апюмокалие- вых или алюмоаммонийных квасцов и 3400-3600 мг/л желатина , устанавли(CTjyi.

ел

оэ

4

315

вая рН среды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой.

Низкий уровень рН определяет переход нерастворимых солей алюминия в раствор с образованием АР . При выборе соединений алюкиния следует оценивать их не только как поставщиков катиона Al +3 „ но и с точки зрения присутствия в среде анионов до- полнительно к тому минеральному составу, на основе которого приготовлена среда. Так, например, предпочтительнее использовать алюмоаммонийные или алюмокалиевые квасцы, чем хлорис- тый алюминий (избыток С1 в среде нежелателен) .

При расчетах доз алюминия следует иметь ввиду, что при повышении рН

соответствии с классификацией почв на слабокислые с рН 5-6(серые лесные оподзоленные), кислые с рН 4-5 (дер- новоподзолистые и подзолистые) и сильно кислые с рН (торфяные и болотистые) .

Исходя из того, что свыше 50% почв Нечерноземной зоны имеют кислую реакцию, предлагается селективная среда для регенерации зерновых злаков из недозрелых зародышей с целью получени форм, устойчивых к кислым почвам с токсическим действием алюминия (в мг/л):

Среда I (для инициации каллуса) : макро- и микросоли по Мурасиге и Ску- гу; сахароза 20000-30000; агар-агар 6000-7000; желатин 3400-3600; витами

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, при селекционно-генетических исследованиях. Целью изобретения является получение устойчивых к токсическому действию AL⁺ растений, пригодных для выращивания на кислых почвах. Способ состоит в том, что осуществляется получение растений-регенерантов ячменя (НоRDеUм VULGaRe) на питательной среде из незрелых зародышей, при этом в среду, составленную на основе среды Мурасиге-скуга с добавками стимуляторов и фитогормонов, дополнительно вводят алюминий в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов и для поддержания желеобразной консистенции среды - желатин, при этом устанавливают кислый рН серной или соляной кислотой.

количество катиона А13 в среде умень о ны по &5: тиамин миоинозитол

80-100, пиридоксин - НС1 0, ник типовая кислота 0,5-1; дихлорфенокси сусная кислота (2,4д) 2-3; А13 7-9 ГКАКЗО -ПН О 140-180 J.

шается, при понижении увеличивается. Если при концентрации алюминия 10 мг/л количество АР в среде при рН 4,5 составляет 3,6 1 0 эмоль/л, ITO при 4,0-3,58-10-, при рН 3,5-3,6 107, а при рН 3,0-3,6-10 При пред лагаемой концентрации алюминия (7 9 мг/л) фосфора выпадает в осадок при рН 4,0-3,5 до 30% от исходного содержания, что допустимо для развития растений-регенерантов. Чем ниже рН среды, тем меньше образуется каллусов и регенерировавших из них растений. При рН 3,5 и ниже каллусная ткань от первичной посадки не формируется или быстро погибает.

Кроме того, агар-агар в кислой среде не желируется. Плотную или желеобразную среду в этом случае можно получить, используя смесь агар-агара и желатина, который желируется в более кислых условиях. Достоинства этой смеси в том, что она дает плотную или желеобразную изотропную среду при кислом рН. Использование одного желатина невозможно, так как он образует при застывании грубую ячеистую структуру, препятствующую контакту эксплантата со средо Поскольку желатин после автоклавиро- вания подщелачивает среду, рН среды перед автоклавированием должен быть ниже заданного для эксперимента.

Желеобразная среда хорошо удержи

На среду I высаживают незрелые з родыши 6 селекционных образцов ячме щитком вверх в возрасте 10-14 дней после опыления. Высаживают по 30

вает на поверхности эксплантат, позволяет наклонять и даже класть пробирку пробирок каждого образца по 8 зарово время работы.

Для эксперимента берут три уровня кислотности сред: рН 4,8-4,1-3,8 в

ны по &5: тиамин миоинозитол

80-100, пиридоксин - НС1 0, нико-, типовая кислота 0,5-1; дихлорфеноксиук- сусная кислота (2,4д) 2-3; А13 7-9; ГКАКЗО -ПН О 140-180 J.

Среда II (для получения регенеран- тов из каллуса): макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; сахароза 20000- 30000; агар-агар 6000-7000; желатин 3400-3600, витамины по тиамин 1-Ю; о{- нафтилуксусная кислота (АНУ) 0,5-1; кинетин 0,5-1; АР 7-9; CKA1(S04)4-12H20 140-180.

Для обоих сред устанавливается три значения рН: рН,4,8 (готовой среды),

рН 3,75 (перед автоклавированием); рН 4,1 (готовой среды), рН 3,0 (перед автоклавированием); рН 3,8 (готовой среды), рН 2,7 (перед автоклавированием) .

П р и м е р 1 (контроль). Проводят культивирование незрелых зародышей ячменя на питательной среде следующего состава, в мг/л: макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; сахароза

30000; агар-агар 7000; витамины по

Bs: тиамин 10, миоинозитол 100; пиридоксин - НС1 1, никотиновая кислота 1; 2,4Д 3,0 (среда I для инициации каллуса) или АНУ и кинетин по 1,0 0 (среда II для регенерации), рН 5,8 6,0.

На среду I высаживают незрелые зародыши 6 селекционных образцов ячменя щитком вверх в возрасте 10-14 дней после опыления. Высаживают по 30

пробирок каждого образца по 8 зародышей в одной пробирке - всего 240 зародышей каждого образца. Через 7- 10 дней визуально на поверхности щитка отмечают образование каллуса и его последующее нарастание. В зависимости от генотипа процент образования каллуса составляет 37,,5%- Каллусы находятся на этой среде до появления плотных участков - меристе матических очагов, после чего плотные участки переносят на среду для регенерации Н, на которой из них в течение 4-8 недель образовываются проростки, в зависимости от генотипа в 11-31% случаев{ Оставшийся после переноса плотных участков на среду II каллус пересаживают на среду I для дальнейшего нарастания каллуса и формирования в нем новых меристе- матических зон.

Возможно культивирование незрелых зародышей ячменя на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующим содержанием добавок, мг/л: сахароза 20000; агар-агар - 6000; витамины: тиамин 1; миоинозитол 80; пиридок1

син - НС1 0,5; никотиновая кислота 0,5; 2,4д 2 (для инициации каллуса) или АНУ и кинетин по 0,5 (для регенерации); рН 5,8-6,0.

На этих средах получены результаты, аналогичные вышеприведенным, с той разницей, что при уменьшении количества 2,4д с 3 до 2 мг/л происход ускорение во времени заложения мери- стематических зон. Эти данные дают возможность работать с селективными средами, в основе которых лежит среда следующего состава, мг/л: макро-- и микросоли по Мурасиге и Скугу; сахароза 30000; агар-агар 7000 витамины по В5: тиамин 10; миоинозитол 100; пиридоксин - НС1 1; никотиновая кислота 1; 2,4Д 2 (среда для инициации каллуса) или АНУ 0,5; кинетин 1.

Эту среду в дальнейшем называют основной. На основную среду накладываются предлагаемые факторы: А13 и желатин при разных значениях рН.

П р и м е р 2. Проводят культивирование незрелых зародышей Ячменя на кислой селективной среде I с токсическим действием алюминия следующего состава, мг/л: основная среда, желатин ЗбОО; Al33f 9; рН 4,8 (готовой среды); рН 3,75 (перед автокла- вированием).

На эту среду высаживают незрелые зародыши тех же 6 селекционных образцов ячменя щитком вверх в возра464836

сте 10-14 дней после опыления в количестве около 240 зародышей каждого образца. В зависимости от генотипа про- цент образования каллуса составляет , что несколько ниже контроля. Процент заложения меристематических зон снизился по сравнению с контролем в 2 раза и более и составил 4-16%, что

Ю свидетельствует о токсичности селективной среды с содержанием А13 при рН 4,8.

Не было получено принципиальных отличий по выходу каллуса и меристе15 матических зон при культивировании зародышей на основной среде с содержанием желатина 3400 мг/л, А1 7 мг/л при рН 4,8. Поэтому для проведения третьего и четвертого эксперимента

20 было взято в дополнение к основной среде, мг/л: желатин 3500; . Условия третьего и четвертого экспериментов были изменены за счет понижения рН среды.

25 ПримерЗ- Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2 на среде следующего

состава, мг/л: основная среда; жела

тин 3500; АР 8; рН 4,1 (готовой

среды); рН 3,0 (перед автоклавирова- нием) .

Как видно из вышеизложенного (с. 5), понижение рН увеличивает , количество А13 в среде, следовательно, повышает ее токсичность. При рН 4,1 среда с содержанием агар-агара и желатина не плотный нель, wo застудневает .

На селективной среде примера 3 получено в зависимости от генотипа при работе на тех же селекционных образцах: каллусов от числа посаженных зародышей 5,2-27,8%, каллусов с мери- стематическими зонами 0,9-6,2%, т.е.

имеет место дальнейшее понижение процента выхода продукции.

П р и м е р 4. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют по схеме примера 2, рН сред составляет

3,8. Эти среды желеобразны и для удобства работы на поверхность их кладут диск фильтровальной бумаги. На селективной среде примера 4 получено каллусов от числа посаженных

зародышей 1,, каллусов с мери- стематическими зонами 0,4-2,9%. Кроме низкого заложения меристематических зон токсичность сред примера 4 проявляется также в быстром потемнении и

отмирании каллусной ткани. Кроме того, при потемнении каллусной ткани ее сразу не выкидывают, так как плотные (меристематические) участки обна- с руживают иногда и на таком каллусе (очевидно, из более устойчивых клеток) . В случаях, когда после заложения меристематических очагов или проростков на среде с рН 3,8 они оста- ю навливаются в росте и развитии, их пересаживают на среды с рН 4,0-4,1 и выше (т.е. на среды с менее жестким режимом).

Дальнейшее понижение рН питатель- 15 ных сред нецелесообразно.

Проростки, полученные на селективных средах примеров 2-4, отсаживают на обычную среду для ускорения и после достижения регенерантами фазы 2-4 листьев высаживают из пробирок сначала в горшочки с землей, а затем в поле, где они завязывают зерно.

Всего от 6 селекционных образцов ячменя получено на селективных средах 91 линия, в том числе на среде с рН А,8 41, с рН 4,1-29, с рН 3,8

П р и м е р 5. Посадку зародышей и их культивирование осуществляют 30 по схеме примера 2. В качестве исходного материала берут зародыши от рас- тений-рег-енерантов, полученных из каллусной ткани на среде с рН 4,8 (т.е. производится повторная посадка 35 на селективную среду).

В эксперименте 5 на среде с рН 3,8 получено от тех же селекционных образцов ячменя каллусов от числа

20

25

ких условиях эксперимента очаги меристемы с последующей регенерацией из них растений, т.е. более устойчивые к данным условиям, в то время, как менее устойчивые погибают на том или ином этапе эксперимента. Тем самым в 5-10 раз сокращается объем работ по оценке растений ин вивои значительно повышается возможность отбора устойчивых форм.

Предлагаемые среды с учетом поправок, вносимых в зависимости от сортовой специфики, могут быть споль- зованы в работе с другими злаковыми сельскохозяйственными культурами.

Формула изобретения

Способ получения растений-регене- рантов Hordeum vulgare, устойчивых к токсическому действию А13 в кислой среде, включающий культивирование незрелых зародышей и получение из них регенерантов на питательной среде, минеральной основой которой является среда Мурасиге и Скуга, содержащей дополнительно, мг/л:

Сахароза

Тиамин

Миоинозитол

Пиридоксин-НС1

Никотиновая кислота

Дихлорфенилуксусная

кислота

или с -нафтилуксусная кислота и кинетин

по

Агар-агар

20000-30000

1-10 80-100 0,5-1,0 0,5-1,0

2-3

0,5-1,0

...-„ „.„6000-7000

посаженных зародышей 18-69,3%, каллу- 40 отличающийся тем, что, с сов с меристематическими зонами 1,2- целью повышения выхода устойчивых 19%. Линий ячменя в грунте 92. Этот растений, в среду дополнительно вво- эксперимент свидетельствует о том, дят алюминий в виде алюмокалиевых или что повторное культивирование на алюмоаммонийных квасцов в количестве селективных средах ведет к повышению 45 мг/л желатин в количестве 34003600 мг/л для создания желеобразной

устойчивости материала.

Предлагаемые среды дают возможность в короткий срок (2,5-Ю мес) отобрать каллусы, способные формировать в жест«;

0 5

0

5

ких условиях эксперимента очаги меристемы с последующей регенерацией из них растений, т.е. более устойчивые к данным условиям, в то время, как менее устойчивые погибают на том или ином этапе эксперимента. Тем самым в 5-10 раз сокращается объем работ по оценке растений ин вивои значительно повышается возможность отбора устойчивых форм.

Предлагаемые среды с учетом поправок, вносимых в зависимости от сортовой специфики, могут быть споль- зованы в работе с другими злаковыми сельскохозяйственными культурами.

Формула изобретения

Способ получения растений-регене- рантов Hordeum vulgare, устойчивых к токсическому действию А13 в кислой среде, включающий культивирование незрелых зародышей и получение из них регенерантов на питательной среде, минеральной основой которой является среда Мурасиге и Скуга, содержащей дополнительно, мг/л:

Сахароза

Тиамин

Миоинозитол

Пиридоксин-НС1

Никотиновая кислота

Дихлорфенилуксусная

кислота

или с -нафтилуксусная кислота и кинетин

по

Агар-агар

20000-30000

1-10 80-100 0,5-1,0 0,5-1,0

2-3

0,5-1,0

...-„ „.„6000-7000

0 отличающийся тем, что, с целью повышения выхода устойчивых растений, в среду дополнительно вво- дят алюминий в виде алюмокалиевых или алюмоаммонийных квасцов в количестве 5 мг/л желатин в количестве 3400консистенции среды, устанавливая рН среды 4,8-3,8 соляной или серной кислотой .