Способ размножения растений сорго @ @ Советский патент 1984 года по МПК A01H3/00 

СО

со Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений для ускоренного размножения ценных сортов и гибридов сорго, в исследованиях по экспе&имен тальному мутагенезу, генетике и физи ологии морфогенеза. Известен способ получения регенерантов для злаков, в частности для овса. Он заключается в культивироваНИИ незрелых зародьшей на среде Мура сиге и Скуга с 2,4Д 0,5-3 мг/л на свету 3 тыс. лк. Регенерацию растений получали на среде, не содержа шей 2,4 Д. Быпи получены регенеранты у 16 сортов р J. Недостатком способа является огра ниченньм временной интервал получения культур с регенерационной (органогенной) способностью в связи с необходимостью использования незрелых зародышей. Попытки получения регенерантов в культуре зрелых зародышей данным способом позволили получить регенерацию только у одного из 5 изу ченных сортов. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения растений регенерантов из каллуса от щитка незрелых зародьвпей сорго. На среде с макро- и микроэлементами по Мурасиге и Скугу, витаминами по Гамборгу, сахарозой 30 г/л, глицерином, ci-аспарагином, никотинамидом, пантотенатом кальция, 2,4Д и зеатином наблюда лись каллусогенез и формирование сте левых побегов при культивировании на свету при 2 тыс. лк, фотопериоде 20ч при 20с. Регенеранты получали на среде с ИУК 0,1-5 М через 8-10 недель 2. Недостатком известного способа яв ляется относительно невысокий процент .зародьппей от которых бьши получены культуры с каллусом и побегами (20-50%). Кроме того, процесс получения кул тур с регенерационной способностью ограничен во времени необходимостью использования незрелых зародышей. В связи с этим указанный способ не может найти широкого применения в с елек1ши. Цель изобретения - увеличение выхода растений за счет повьппения коли чества зародышей, способных к образо ванию культур с органогенной активностью. Цель достигается тем, что соглясно способу размножения растений сорго in vitro зрелые зародьшш культивируют в темноте на питательной среде с кинетином или 6-бензиламинопурином, при этом культуры с очагами- органогенной активности получают 0т ткани самого зрелого зародьшга. Кинетин или 6-бензиламинопурин вводят в концентрации 0,1-1,0 мг/л в питательную среду для получения и размножения культур с очагами органогенной активности. Способ осуществляется следующим образом. Зерновки сорго обрабатывают 70%-ным этиловым спиртом в течение 30 с, стерилизуют 15 мин водным раствором диацида, промьшают тремя порциями воды и.замачивают в течение 20-24 ч в дистиллированной воде при 18-22 0. По истечении указанного времени зерновки в операционной комнате дополнительно стерилизуют диацидом в течение 5-6 мин и промывают тремя порциями стерильной воды. В стерильных условиях вычленяют зародыши и помещают в пробирки на питательную агаризованную среду щитком кверху так, чтобы собственно зародыщ находился в контакте со средой. Питательная среда готовится на бидистиллированной воде. В среду включают макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, витамины, сахарозу 30000 мг, агар 7000 мг, 2,4 D 1-3 мг, 6-ВАЛ - 0,1-1,0 мг на 1 л среды. Перед автоклавировйнием рН среды доводят до 5,8-6,0. Культивирование проводят в темноте и на свету при температуре 26 1 и относительной влажности 70-80%. Анализ культур проводят под стереоскопическим микроскопом МБС-2. В первую неделю культивирования наблюдается некроз щитка и происходит развитие плотного бугристого желтого каллуса от ткани зародыша, на котором через 2-4 недели формируются очаги с органогенной активностью: участки прозрачной или белой ткани с глобулярными структурами или конусовидными вьфостами (зачатками растений) . Для дальнейшего размножения такие очаги две-три части вместе с прилегающим каллусом, переносят на среду исходного состава и культИйир5пот в темноте Для прорастания зачатков их отделяют с помощью препаровальных игл и переносят на среду, отличающуюся от среды исходного состава тем, что вместо ауксина 2,4 Д и цитокинина она содержит ИУК 0,2-1,0 мг/п. Культивирование проводят на свету в условиях фотопериода 16 ч и температуры 25f . Глобулярные структуры и конусовидные выросты через 3-4 недели дают начало массовому развитию проростков. Для формирования растений такие проростки снова переносят на среды с ИУК 0,2-1,0 мг/л. От каждого эксплантата из О пассажа (под О пассажем понимают культивирование in vitro исходного эксплантата), в зависимости от сорта возможно получение от 10 до 30 растений. Из следующего пассажа

Таблица 1 за счет размножения исходного эксплантата число растений может возрасти в 2-3 раза. Развиваются морфологически нормальные растения - регенеранты, пригодные для.пересадки в вегетационные сосуды в теплицу. Способ опробирован на четырех сортах и двух гибридах сорго,включающих представителей разных эколого-географических разновидностей (видов) полиморфного рода Sorghum: Зерновое-Желтозерное- 10 (Майло, S. subgabrescens)J Кафрское (S. caffrorum) - Норгум,болжское - 2 (сорт селекции лаборатории сорго Саратовского СХИ), SD - 102 гибриды А Ефремовское - 2хГаолянК1046, А153хВИР-21. Результаты сведены в табл. 1-4.

1. СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ СОРГО IN VITRO путем получения культур с органогенной активностью из зародышей на агаризованной питательной среде с цитокининами, их размножение на среде исходного состава и получение на свету растений-регенерантов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода растений за счет повышения количества зародьшей, способных к образованию культур с органогенной активностью, зрелые зародыши культивируют в темноте на питательной среде с кинетином или 6-бензиламинопурином, при этом культуры с очагами органогенной активности получают от ткани самого зрелого зародьша. 2. Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что в питательную среду для получения и размножения культур с органогенной активностью кинетин или 6-бензиламинопурин вводят в концентрации 0,1-1,0 мг/л.

Желтозерное-10

19 20 9

Норгум-165

Волжское-2

2хГаолян18

17

По всем сортам

83 В табл. 1 представлены результаты культивирования зародышей испытанных сортов и гибридов сорго в темноте на среде, содержащей цитокинин 6-БАП (1 мг/л). Установлена изменчивость исходного материала по способности давать куль туры с зачатками растений. Лучший результат наблюдается у сорта Норгум, тем не менее, полученные частоты возникновения культур с зачатками расте10 20 7

52,6

100,0

77,8

5

27,8

10 58,8

52

62,6 НИИ позволяют вести работы на всех сортах и гибридах, имеюпщх селекционное значение. В табл. 2 показано количество культур с зачатками растений в зависимости от концентрации в среде цитокинина (кинетина). Повьпиенне концентрации кинетина увеличивает число культур с зачатками растений в 2-i 3 раза.

Табл. 3 иллюстрирует целесообразность культивирования зародьшей в темноСледует отметить, что 80-100% исходных культур с зачатками растений, высаженных на среду для регенерации, формировали множество проростков.

Таблица 2

те для получения культур с зачатками растений (среда с кинетйном 1 мг/л) .

Таблица 3

из которых получено большое число развитых растений - регенерантов (до 20-30 шт. от одной культуры). Результаты представлены в табл.5,

Предла- Жептозергаемый ное-10

Норгум-165 Волжское-2 5В-1П2

А Ефремовское-2хГаоЛЯН-К1046

А 153хВИР-21 В среднем Всего 67,0 82

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известными способами, в том числе и с базовым объектом, позволяет увеличить процент выхода растений - регенерантов сорго. При этом за базовый объект взят про- 50 тотип изобретения, имеющий наилучший результат по регенерации растений в культуре сорго. Если в базовом объекте количество зародышей, от которых получают каллусы с побегами, колеб- 55 лется от 20 до 50%, то в предложен- . ном способе этот же показатель варьирует от 31,3 до 100% при среднем знаТаблица 4

1138

13,9

чении по всем изученным сортам 67,0% что превосходит максимальное значение, достигнутое в базовом объекте.

Преимущества изобретения заключаются в том, что: во-первых, культивирование зрелых зародышей позволяет иметь материал, пригодный к хранению и доступный для размножения в любое время года, во-вторых, культивирование в темноте в 2-3 раза увели чивает число культур с зачатками растений в-третьих, обеспечивается возможность получения растений-регенерантов у больщего числа генотипов:

из 6 испытанных сортов все 6 далиразмножение уникальных генотипов,

равтения - регенеранты.гибридов, мутантов сорго различного

Использование предлагаемого спо-исходного селекционного материасоба позволит проводить ycKOpe iHoeла.