СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРА-, ТРИ-, ДИ- И МОНОГАЛАКТУРОНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 1995 года по МПК C08B37/06 

Изобретение касается фракционирования пектинов на тетра-, три-, ди- и моногалактуроновые кислоты и может найти применение для изучения состава пектинов различного происхождения, а также использования этих галактуроновых кислот в качестве свидетелей при изучении биосинтеза полисахаридов, в качестве исходного материала (моногалактуроновая кислота) для синтеза физиологически активных веществ (аскорбиновой кислоты и др.) или в качестве лечебного средства (моногалактуроновая кислота) при лечении анемии, интоксикациях и т.д.

Известен способ получения моногалактуроновой кислоты из пектина ферментативным путем, заключающийся в том, что пектин деметоксилируют при pH 3,5, затем обрабатывают ферментным препаратом, обогащенным пектиназой, который расщепляют β -гликозидные связи пектина. Далее в присутствии толуола проводят ферментолиз при 39^оС в течение двух недель. В процессе ферментолиза образуется смесь полиуронидов различной молекулярной массы. Затем моноголактуроновую кислоту отделяют от полиуронидов и неуронового комплекса пектина, осветляют полученный фильтрат активированным углем. Далее гидролизат упаривают под вакуумом, обрабатывают смесью эфира и спирта (3:5). При этом моногалактуроновая кислота переходит в раствор, который отделяют, концентрируют под вакуумом и кристаллизуют моногалактуроновую кислоту, после чего кристаллы фильтруют, очищают и высушивают. Выход моногалактуроновой кислоты составляет 27%. Продолжительность способа 1 мес. /1/.

Недостатками способа являются:
потеря ди-, три-, тетрагалактуроновых кислот;
сравнительно невысокий выход моногалактуроновой кислоты (27%);
необходимость (для повышения выхода) проведения стадии деметоксилирования пектина;
недостаточная чистота моногалактуроновой кислоты (содержание моногалактуроновой кислоты в полученной фракции составляет 78,2%), в качестве примесей содержатся остатки моносахаридов);
использование ферментные препараты, состоящие из экзо-ферментов, частично отщепляющих концевые остатки моносахаров от пектинов и эндо-ферментов, расщепляющих пектин на фрагменты. Это способствует ступенчатому гидролизу, а следовательно, уменьшению скорости гидролиза. Кроме того, ферментные препараты представляют собой комплекс ферментов, избирательно действующий на молекулярно-неоднородные пектины;
ферментные препараты, обогащенные пектиназой, в основном расщепляют β -гликозидные связи, почти не затрагивая α-связи;
ферментные препараты являются легко лабильными действуют в строго определенных интервалах температуры и pH среды, т.к. при высоких температурах, сильнокислых и сильнощелочных средах происходит необратимая денатурация белковой молекулы фермента, сопровождающаяся утратой последним каталитической активности, т.е. фактическим снижением концентрации фермента;
ферментные препараты дорогостоящи, дефицитны, с малым сроком годности;
длительность (особенно если используется не пектиназа, а ферменты группы пектиназ - пектафоетидин, пектаавамарин) и многостадийность способа получения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ одновременного получения тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот из свекловичного пектина (2). Способ включает гидролиз свекловичного пектина с использованием фермента "пектиназа" при термостатировании раствора при 40^оС в течение 96 ч, обработку раствора образованных галактуроновых кислот карбонатом бария и фракционное осаждение полученных бариевых солей этанолом. При этом соли тетрагалактуроновой кислоты осаждают этанолом с концентрацией менее 40% (24%), соли тригалактуроновой кислоты - 40%-ным этанолом, соли дигалактуроновой кислоты - 50%-ным этанолом и соли моногалактуроновой кислоты - 90%-ным этанолом. Соли растворяют в воде, растворы пропускают через катионит в Н⁺ форме. Целевые продукты выделяют и сушат.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода и чистоты целевых продуктов.

Указанная цель достигается тем, что в способе одновременного получения тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот из свекловичного пектина, включающем его гидролиз, обработку раствора галактуроновых кислот карбонатом бария, фракционное осаждение образующихся бариевых солей из водного раствора этанолом: солей тетрагалактуроновой кислоты при концентрации этанола менее 40%, солей тригалактуроновой кислоты - 40%-ным этанолом, солей дигалактуроновой кислоты - 50%-ным этанолом и солей моногалактуроновой кислоты - 90%-ным этанолом, пропускание их растворов через катионит в H⁺-форме с последующим выделением и сушкой целевых продуктов, гидролиз пектина осуществляют кипячением его водного раствора в течение 10 мин с последующим добавлением к нему 15%-ного сульфата лития при массовом соотношении пектин: сульфат лития 1: 15, после чего фильтрат пропускают через катионит в Н⁺-форме, а для последующего фракционного осаждения тетрагалактуроновой кислоты используют 30%-ный этанол.

Способ осуществляется следующим образом.

Водный раствор промышленного свекловичного пектина кипятят в течение 10 мин. Затем к нему добавляют 15%-ный раствор сульфата лития при соотношении пектин: сульфат лития 1:15, фильтруют. Фильтрат, содержащий уроновые кислоты, освобождают от катионов лития и других катионов, которые сопровождают пектины, пропусканием его через катионит КУ-1 или КУ-2 в Н⁺-норме. Фильтрат, содержащий уроновые кислоты, при нагревании смешивают с карбонатом бария для связывания уроновых кислот в их бариевые соли. Далее фильтрат упаривают и осаждают бариевые соли уроновых кислот этиловым спиртом различной концентрации в следующей последовательности: бариевые соли тетрагалактуроновых кислот - 30% этанолом, бариевые соли тригалактуроновых кислот - 40% этанолом, бариевые соли дигалактуроновых кислот - 50% этанолом, бариевые соли моногалактуроновых кислот - 90% этанолом. Затем осажденные барийгалактуронаты отфильтровывают, растворяют в воде и с помощью катионита КУ-1 или КУ-2 в Н⁺-форме переводят в свободные тетра-, три-, ди- и моногалактуроновые кислоты. Полученные растворы концентрируют под вакуумом и кристаллизуют при 5^оС. Кристаллы галактуроновых кислот отделяют и сушат в вакуум-сушильном шкафу.

Для идентификации и оценки качества тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот использовали следующие методы:
качественные реакции (общие на все галактуроновые кислоты) 0,10 г галактуроновых кислот растворяли в 20 мл воды, полученные растворы анализировали;
к 3 мл растворов тетра-, три-, ди- или моногалактуроновых кислот прибавляли 4-5 капель концентрированной серной кислоты, нагревали на кипящей водяной бане 10 мин, затем добавляли 4 капли раствора флороглюцина и нагревали еще 5 мин, все растворы окрашивались в оранжевый цвет, что свидетельствовало о наличии уроновых кислот в гидролизатах;
к 3 мл растворов тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот прибавляли 5 мл концентрированной серной кислоты, нагревали 10 мин в кипящей водяной бане, затем прибавляли 0,35% мл 0,5%-ного спиртового раствора карбазола, растворы приобретали вишнево-малиновую окраску, максимальная оптическая плотность которых соответствовала длине волны 530 нм, что характерно для галактуроновых кислот;
к 5 мл растворов тетра-, три-, ди- или моногалактуроновых кислот приливали 5 мл концентрированной соляной кислоты, растворы кипятили в течение 1 мин, затем добавляли 1 мл 1%-ного спиртового нафторезорцина. После охлаждения смесь экстрагировали эквивалентным объемом эфира. Галактуроновые кислоты в гидролизатах обнаруживались по появлению очень характерной сине-фиолетовой окраски и абсорбционной полосы при 565 нм;
к 5 мл испытуемых растворов приливали 20 мл концентрированной серной кислоты при охлаждении, затем 0,1 мл 2,5%-ного раствора моногидрата солянокислого L-цистеина, смеси оставляли на сутки. Появлялась зеленовато-синяя окраска, специфичная для галактуроновых кислот;
к 5 мл испытуемых растворов приливали 5 мл 2%-ного раствора основного ацетата свинца, смесь нагревали 5 мин, появлялся розовый осадок, который через несколько минут превращался в коричнево-красный.

Метод бумажной хроматографии (БХ).

Метод БХ позволяет отличить целевые продукты друг от друга.

Использовали системы растворителей:
А. Этилацетат-уксусная кислота-вода (10:5:6),
Б. бутанол-пиридин-вода (3:2:1,5),
В. уксусная кислота-бутанол-вода (1:4:5).

В качестве проявителей использовали соответственно п-анизидин солянокислый, анилинфталат, бензидин.

Наиболее удовлетворительной системой растворителей для разделения тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот является система А. На хроматограмме были обнаружены следующие 4 пятна с R_f=0,30; 0,15; 0,08; 0,05. В сравнении со свидетелями эти пятна идентифицированы как соответственно моно-, ди-, три- и тетрагалактуроновые кислоты. Причем на хроматограмме обнаружено характерное для моногалактуроновой кислоты пятно сердцеобразной формы. 4 пятна с этими же значениями R_f были обнаружены и в системах растворителей Б и В. В сравнении с достоверными образцами свидетелей они идентифицированы как моно-, ди-, три- и тетрагалактуроновые кислоты. Регулярность в значениях R_f этих четырех пятен (моно-, ди-, три-, тетрагалактуроновых кислот) позволяет предположить, что они являются представителями одного гомологического ряда. Эта закономерность становится еще более явной, если вычислить значения R_m-log(1/R_f-1). Они соответствуют 0,36 (моногалактуроновая кислота), 0,75 (дигалактуроновая кислота), 1,06 (тригалактуроновая кислота), 1,30 (тетрагалактуроновая кислота).

3. Оценка чистоты целевых продуктов экстракционным способом по содержанию балластных веществ. Методика определения заключается в следующем. 2,0000 г (точная навеска) моно-, ди-, три- или тетрагалактуроновых кислот помещали в коническую колбу с 50 мл 0,3 н. раствора соляной кислоты, закрывали пробкой с обратным холодильником и нагревали на кипящей водяной бане. Затем проводили фильтрацию через бумажный складчатый фильтр в мерную колбу на 500 мл. Остаток на фильтре промывали несколько раз горячей водой, сливая промывные воды в ту же колбу, заливали 50 мл 1%-ного раствора лимоннокислого аммония и нагревали на кипящей водяной бане 30 мин. Фильтрацию проводили в ту же мерную колбу через взвешенный и высушенный до постоянной массы фильтр. Осадок промывали горячей водой и сушили до постоянной массы. Содержание балластного материала, рассчитывали по отношению к взятой навеске.

Оценка чистоты выделенных фракций по спектрам поглощения продуктов взаимодействия этих фракций с раствором орцина в сильнокислой среде. Для этого к 10 мл 2% -ного растворов тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот добавляли по 6 мл раствора орцина (0,1 г орцина в 100 мл 85%-ной серной кислоты) нагревали на кипящей водяной бане 15 мин. При этом происходил гидролиз тетра-, три-, дигалактуроновых кислот до моногалактуроновой кислоты. Снимали спектры поглощения продуктов взаимодействия, раствором сравнения служил орцин. Установлено, что в спектрах поглощения продуктов, полученных взаимодействием исследуемых галактуроновых кислот, полученных заявляемым способом, с орцином, имеется только один максимум поглощения при длине волны 420 нм, других максимумов не наблюдалось, что свидетельствовало о чистоте полученных целевых продуктов. В спектрах поглощения продуктов, полученных взаимодействием галактуроновых кислот (полученных известным способом) с орцином, кроме максимума поглощения при длине волны 420 нм наблюдались и другие максимумы; для фракции моногалактуроновых кислот при длине волны 370 нм, для фракции моногалактуроновых кислот при длине волны 370 нм, для фракции дигалактуроновых кислот при длине волны 370 нм, для фракций три- и тетрагалактуроновых кислот - по 2 максимума при длие волны 370 и 400 нм. Эти максимумы характеризуют наличие примесей во фракциях галактуроновых кислот, полученных известным способом.

Количественное содержание галактуроновой кислоты (уронидной составляющей) определяли в целевых продуктах карбазольным методом. Методика определения предполагает стадию гидролиза ди-, три- и тетрагалактуроновых кислот до моногалактуроновой кислоты. Результаты анализа (95-98%) свидетельствуют о высоком количественном содержании галактуроновых кислот в целевых продуктах, а также об их высокой степени чистоты. Фракция моногалактуроновой кислоты, полученная по известному способу содержала галактуроновой кислоты 78,2%.

П р и м е р 1. 2,0000 г свекловичного пектина растворяют в 100 мл дистиллированной воды с перемешиванием на магнитной мешалке. Раствор пектина кипятят в течение 10 мин на электроплитке, после чего к нему добавляют 200 мл 15%-ного раствора сульфата лития и через 5 мин фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат пропускают через катионит КУ-1 в Н⁺-форме /для освобождения от лития и других катионов/, катионит промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод по универсальному индикатору. Раствор и промывные воды объединяют, нагревают до 55^оС, добавляют к ним карбонат бария для нейтрализации серной кислоты, образовавшейся в результате катионного обмена на катионите (по индикатору конго-рот до появления устойчивого красного цвета). Раствор отделяют от выпавшего в осадок сульфата бария фильтрованием его через бумажный фильтр. Фильтрат, содержащий бариевые соли галактуровых кислот, концентрируют под вакуумом до объема 30 мл. Затем к сгущенному раствору добавляют этиловый спирт с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация в фильтрате была 30%, т.е. 30 мл сгущенного водного раствора добавляют 10,6 мл 96%-ного этанола. При этом осаждаются бариевые соли тетрагалактуроновых кислот, которые отфильтровывают. К оставшемуся фильтрату добавляют этиловый спирт с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация в фильтрате была 40%. При этом осаждаются бариевые соли тригалактуроновых кислот, осадок отделяют фильтрованием его через бумажный фильтр. Далее, к оставшемуся фильтрату добавляют этиловый спирт с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация в фильтрате была 50%. При этом осаждаются бариевые соли дигалактуроновых кислот, их отделяют от фильтрата. И, наконец, к оставшемуся фильтрату добавляют этанола столько, чтобы его конечная концентрация в фильтрате была 90%. При этом осаждаются бариевые соли моногалактуроновых кислот, их отделяют фильтрованием. Оставшийся маточный раствор используют для регенерации из него этанола.

Выделенные бариевые соли галактуроновых кислот промывают спиртом, растворяют в воде (примерно 100 мл) и переводят в свободное соответственно тетра-, три-, ди- и моногалактуроновые кислоты пропусканием растворов бариевых солей галактуронатов через катионит КУ-1 в Н⁺ форме. Катионит отмывают от галактуроновых кислот дистиллированной водой до тех пор, пока универсальный индикатор от вытекающей из колонки жидкости не станет бесцветным. Полученные растворы свободных галактуроновых кислот концентрируют под вакуумом до объема примерно 10-15 мм, кристаллизуют при температуре 5^оС. Выпавшие кристаллы отделяют от маточного раствора и сушат в вакуум-сушильном шкафу.

Чистоту полученных тетра-, три-, ди- и моногалактуроновых кислот анализировали:
методом бумажной хроматографии в системе растворителей: этилацетат-уксусная кислота-вода (10:5:6), проявитель - n-анизидин солянокислый. Проявленные хроматограммы высушивали при 105^оС в течение 30 мин. На хроматограмме было обнаружено 4 пятна коричневого цвета с R_f=0,30 (моногалактуроновая кислота), R_f= 0,15 (дигалактуроновая кислота), R_f=0,08 (тригалактуроновая кислота), R_f= 0,05 (тетрагалактуроновая кислота). При этом отсутствовали пятна, обусловленные примесями.

По количественному содержанию галактуроновой кислоты в полученных целевых продуктах, определенному карбазольным методом спектрофотометрически, содержание галактуроновой кислоты составило: во фракции тетрагалактуроновой кислоты - 95,88%, во фракции тригалактуроновой кислоты - 94,75%, во фракции дигалактуроновой кислоты - 95,15%, во фракции моногалактуроновой кислоты - 98,02%.

по определению балластных веществ. Содержание балластных веществ составило: во фракции тетрагалактуроновых кислот - 0,060%, во фракции тригалактуроновых кислот - 0,055%, во фракции дигалактуроновых кислот - 0,040%, во фракции моногалактуроновых кислот - 0,015%.

по максимуму светопоглощения продукта взаимодействия целевых продуктов с раствором орцина в сильнокислой среде (после гидролиза целевых продуктов до моногалактуроновой кислоты). Во всех четырех полученных фракциях был обнаружен только 1 максимум светопоглощения при длине волны 420 нм. Это соответствует светопоглощению свидетеля - 2%-ного раствора стандартной моногалактуроновой кислоты. Других максимумов, характерных для веществ, являющихся примесями, не обнаружено.

Физико-химические свойства целевых продуктов.

Моногалактуроновая кислота: мол. м. 212,18 (по литературным данным 212,16), т.пл. 155-158^оС (по литературным данным 156-158^оС).

Удельное вращение [α]_D²⁰=+55,4 (по литературным данным +55,3).

Дигалактуроновая кислота: мол.м. 407,36
Тригалактуроновая кислота: мол.м. 602,54
Тетрагалактуроновая кислота: мол.м. 797,72.

Выход тетрагалактуроновых кислот 0,1156 г или 5,78% к исходному пектину; выход тригалактуроновых кислот 0,2004 г или 10,02% к исходному пектину; выход дигалактуроновых кислот - 0,4462 г или 22,31% к исходному пектину; выход моногалактуроновых кислот - 1,0566 г или 52,83% к исходному пектину.

Продолжительность способа - 3 ч.

Все целевые продукты представляют собою белые порошки, легко растворимые в воде, нерастворимы в этаноле, эфире, ацетоне.

П р и м е р 2. 2,0000 г свекловичного пектина растворяют в 100 мл дистиллированной воды с перемешиванием на магнитной мешалке. Раствор пектина нагревают при 90^оС в течение 5 мин, после чего к нему добавляют 200 мл 1% -ного раствора сульфата лития и через 5 мин фильтруют через бумажный фильтр.

Далее проводят все операции, как описано в примере 1.

Выход тетрагалактуроновых кислот 0,1068 г или 5,34% к исходному пектину, выход тригалактуроновых кислот 0,1834 г или 9,17% к исходному пектину, выход дигалактуроновых кислот 0,4050 г или 20,25% к исходному пектину, выход моногагактуроновых кислот 1,0048 г или 50,24% к исходному пектину.

Продолжительность способа 3 ч.

П р и м е р 3. 2,0000 г свекловичного пектина растворяют в 100 мл дистиллированной воды с перемешиванием на магнитной мешалке. Раствор пектина нагревают при 80^оС в течение 15 мин, после чего к нему добавляют 200 мл 20% -ного раствора сульфата лития и через 5 мин фильтруют через бумажный фильтр.

Далее проводят все операции, как описано в примере 1.

Выход тетрагалактуроновых кислот 0,1152 г или 5,76% к исходному пектину, выход тригалактуроновых кислот 0,1152 г или 5,76% к исходному пектину, выход тригалактуроновых кислот 0,1996 г или 9,98% к исходному пектину, выход дигалактуроновых кислот 0,4460 г или 22,30% к исходному пектину, выход моногалактуроновых кислот 1,056 г или 52,82% к исходному пектину.

Продолжительность способа 3 ч.

Использование: в медицине, фармации и в органическом синтезе. Сущность изобретения: водный раствор свекловичного пектина кипятят 10 мин, добавляют 15% -ный раствор сульфата лития, фильтруют, фильтрат пропускают через катионит в H⁺ К фильтрату добавляют карбонат бария, выпавшие соли растворяют в воде, осаждают соли тетрагалактуроновой кислоты 30% этанолом, тригалактуроновой - 40% этанолом, дигалактуроновой - 50% этанолом и моногалактуроновой - 90% этанолом. Соли растворяют в воде, раствор пропускают через катионит в H⁺ Целевые продукты выделяют и сушат.

СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРА-, ТРИ-, ДИ- И МОНОГАЛАКТУРОНОВЫХ КИСЛОТ из свекловичного пектина, включающий его гидролиз, обработку раствора галактуроновых кислот карбонатом бария, фракционное осаждение образующихся бариевых солей из водного раствора этанолом : солей тетрагалактуроновой кислоты - при концентрации этанола менее 40%, солей тригалактуроновой кислоты - 40%-ным этанолом, солей дигалактуроновой кислоты - 50%-ным этанолом и солей моногалактуроновой кислоты - 90%-ным этанолом, растворение солей в воде, пропускание их растворов через катионит в Н⁺ форме с последующим выделением и сушкой целевых продуктов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода и чистоты целевых продуктов, гидролиз пектина осуществляют кипячением его водного раствора в течение 10 мин с последующим добавлением к нему 15%-ного раствора сульфата лития при массовом соотношении пектин : сульфат лития 1 : 15, после чего фильтрат пропускают через катионит в Н⁺ форме, а для последующего фракционного осаждения тетрагалактуроновой кислоты используют 30%-ный этанол.