Штамм @ @ АТ-490 - продуцент целлюлаз Советский патент 1986 года по МПК C12N9/42 C12N1/14 C12N9/42 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологической промьгашенности, в частности к получению целлюлолитических ферментов микробного происхождения, используемых в процессе осахарива- ния целлюлозы.

Цель изобретения - штамм микроскопического гриба т продуцент термостабильных высокоактивных целлюлаз, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу.

Предлагаемый штамм Aspergillus terreus АТ-490 получен в результате ультрафиолетового облучения исходного штамма Aspergillus terreus 17Р дозой 6400 Дж/м .

Чтамм депонирован в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов Института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232.

Предлагаемый штамм имеет следующу характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Культура хорошо развивается на среде Чапека-Докса, модифицированной среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта и полоски фильтровальной бумаги на поверхности агара, сусло-агаре, а также на природных питательных субстратах.

Среда Чапека-Докса. На 5-е сутки колонии желтоватые, постепенно пёреходявще в бежевый цвет, бархатистые, плоские. Обратная сторона бес цветная. Мицелий гриба имеет тонкие гифы, слабо септированные или совсем не септированные. Средняя толщина гиф 3-4 мк, Конидиеносцы гладкие, бесцветные, до I00 мк в длину и 6- 8 мк в ширину. Пузыри полусферические 15-18 мк в диаметре. Их верхняя часть покрыта стеригмами. Стеригмы двухъярусные,обычно тесно прилегающие, стерип-ш первого яруса (3-4) 2 мк, второго яруса (5-6)-2 мк. Конидиии эллиптические, гладкие, встречаются по отдельности или соединены в цепочки. Диаметр конидии 2- 3 мк.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо усваивает лактозу, глюкозу, ксилозу, мальтозу, сахарозу и целлюлозу. Слабее усваивает араби- нозу, галактозу, юуахмал и маннит. Не усваивает рамиозу, рафинозу, ман- нозу и сорбит. Из источников азота хорошо усваивает органические и неорганические соединения азота. Наиболее интенсивный рост наблюдается на нитратах. Усваивает разнообразные фосфорные соединения, однако более

1Штенсивно одно- и двузамещенный фос форнокислый калий. Штамм высокую эн- доглюканазную (р-1 ,4-1 -глюкан-4- -глюканогидролазы) и целлобиазную активности выявляет в пределах рН

4,5 - 4,6. Оптимальная температура для роста и биосинтеза . Штамм гидролизует целлюлозу (разные целлюлозные субстраты). Наблюдается высокая эндоглюканазная и целлобиазная

активности на среде, содержащей сено в качестве единственного источника углерода.

Целлюлаза предлагаемого штамма термостабильна - после ведения ферментативной реакции при 70°С в течение часа активность почти полностью сохраняется.

Для размножения штамма применяют модифицированную агаризованную среду

Чапека-Докса состава, %: NaNOg 0,3; ,0,2; MgSO -yHjO 0,05; кукурузный экстракт 1,5; агар-агар 2,0, полоска фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3.

Посевным материалом служит суспензия 20- суточной культуры штамма, выращенной на модифицированной среде Чапека-Докса. Для получения иеллюлаз используют жидкую питательную среду

состава, %: NaNO,0,30; КН,РО 0,2; MgSO, 0,05; сено 2; кукурузный экстракт 1,5, рН среды 4,5.

150 мл питательной среды в конических колбах емкостью 250 мп стерилизуют 40 мин при 0,7 атм. Максимальная активность целлюлаз отмечается при выращивании штамма на термостатированной качалке, делающей 270 об/мин при 40 С в течение 96 ч и равна:

активность эндоглюканазы по КМЦ

20 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге 0,5 ед/мп, по целлобиа- зе 0,5 ед/мл.

Эндоглюканазную активность определяют по действию фермента на Na КМЦ следующим образом, I мл 1,5%- ного раствора субстрата в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в

течение 30 мин при 60 С. За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкмоль восста- навливакмцих Сахаров при 1%-ной кон3

центрации субстрата в минуту. Количество восстанавливающих сахароз определяют по методу Сомоджи-Нель- сона.

Активность по фильтровальной бумаге определяют следующим образом. 50 мг фильтровальной бумаги Ватман (16 см) в 1 мл 0,05 ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют течение часа при 55°С. За единицу активности принимают количество фемента, образующего 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров в минуту. Количество восстанавливающих сахароз определяют по методу Сомоджи-Нель- сона.

Целлобиазную активность определ ют следующим образом. 0,2 мл моль целлобиазы, 1,6 мл 0,05М ацетатного буфера (рН 4,7) и 0,2 мл раствора культуральной жидкости инкубируют в течение

10 мин при 55 С. За единицу активности принимают количество фермента, образующее 2 мкмоль глюкозы за I мин при концентрации целлобиазы 2 10 моль. Определение глюкозы проводят глюкоэооксидазным методом.

Кроме высокоактивных целлюлаз предлагаемый продуцент образует богатую белком (35-40%) биомассу.

Пример 1. Штамм Aspergillus „terreus АТ-490 выращивают на агари- зованной среде, содержащей, %: кукурузный экстракт 1,5; NaNO 0,3; 0,2; MgSO -7H20 0,05, рН и полоску фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды 6,3. Культивирование проводят в течение 72 ч при 40 С. Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 250 мл, содержащие 150 мл среды состава, %: сено 2,0, кукурузный экстракт 1,5; NaNO-j 0,3; KH-jP04 0,2; MgSO 7Н20 0,05, рН среды 4,5. Выращивание культуры проводят на круговой качалке (270 об/мин) в течение 72 ч при

s 0 5

0

5

0

5

0

5

70 С

40°С. Мицелий с остатками сена отделяют, и в культуральной жидкости определяют активности целлюлаз по указанным методам. Активность эндоглю- каназы по Na КМЦ 14,5 ед/мп, активность по фильтровальной бумаге 0,32 ед/мл; по целлобиозе 0,35 ед/мл.

Пример 2. Штамм Aspergillus terreus АТ-490 выращивают согласно примеру 1 в течение 96 ч. Активность целлюлаз определяют аналогично примеру 1 .

Активности ферментов в культуральной жидкости составляют, ед/мл: эндоглюконаза по Na КМЦ 20; активность по фильтровальной бумаге 0,5; по хлопку 0,9-1,0; целлобиаза 0,5 ед/мл; ксиланаза 7-8.

При выдерживании препарата при

в течение часа активности почти полностью сохраняются.

Мутант Asp. terreus АТ-490 обладает не только набором всех ферментов целлюлазного комплекса, но также и высокой ксиланазной активностью. В препаратах целлюлаз ксиланаза обеспечивает более полное расщепление сельскохозяйственных отходов до глюкозы. Ксиланазы гидролизуют геми- целлгапо.зу, которая содержится в растительных и природных субстратах, таких как солома, древесина и т.д.

Пример 3. Штамм Asp. terreus АТ-490 выращивают в колбах Эрленмей- ера емкостью 250 мл, содержащей 100 мл среды состава, г/л водопроводной воды: древесные опилки, измельченные на шаровой мельнице до размеров 0,2-1,0 мм 20,0; NaNO 3,0; 2,0; MgS0.7H,,0 0,5, рН„, 4,2- 4,6, в течение 96 ч, на круговой качалке (230 об/мин)при 40 С.

Культуральную жидкость отделяют от биомассы центрифугированием и опре деляют активность по указанным методам.

Активность ферментов представлена в таблице.

Штамм Aspergillus terreusAT- 490 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИ- генетика, коллекционный номер ЦМПМ F-232) - продуцент целлюпаэ. (Л