СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСТИРЕТИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1995 года по МПК A61K35/14 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской промышленности для получения высокоочищенного транстиретина в качестве антигенного материала.

Транстиретин (ТТР) или преальбумин является полифункциональным белком, выполняющим важную роль в метаболизме витамина А, тиреоидных гормонов и иммунном ответе. В клинической практике определение концентрации ТТР в крови и других биологических жидкостях используют при амилоидозе, заболеваниях печени, новообразованиях различной локализации, травмах, ожогах, воспалительных процессах. Кроме того, определение уровня ТТР в плазме крови является наиболее чувствительным критерием для оценки белково-энергетической недостаточности, сопровождающей критические состояния.

При создании тест-системы к ТТР необходимо выделение и очистка белка, который будет использован в качестве антигена для получения антисыворотки.

Известны способы получения ТТР включают осаждение балластных белков органическими растворителями, диализ супернатанта против буферных растворов, очистку ТТР методом ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.

Наиболее близким к предлагаемому способу получения ТТР является метод, включающий добавление к донорской плазме кристаллического хлорида натрия до конечной концентрации 20% инстилляцию равного объема 5,5% водного раствора фенола (1:1) при постоянном перемешивании, удаление преципитата центрифугированием, диализ супернатанта против проточной воды в течение двух суток, а затем против 0,05 М фосфатного буферного раствора рН 7,5, ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-Sephadex А-50, элюцию ТТР в условиях линейного градиента хлорида натрия от 0 до 0,5 М, гель-фильтрацию на Sephadex G-200. В результате реализации этого метода выход ТТР составляет 260 мг из 2 л сыворотки, степень чистоты препарата 50%
Метод, выбранный в качестве прототипа, обладает рядом недостатков:
многостадийность, низкий выход белка, высокая стоимость продукта и тест-системы, применяемой в клинической практике;
низкая степень чистоты конечного белка не позволяет использовать его в качестве антигена;
использование при выделении экологически опасных веществ фенола.

Цель изобретения состоит в повышении чистоты ТТР, увеличении выхода продукта, упрощении и удешевлении производства белка. Для этого в предлагаемом способе сыворотку (плазму) крови человека или кадавера разводят 0,03-0,1 М ацетатным буферным раствором, рН 4,0-4,6, нагревают при 65-75^оС в течение 30-60 мин, затем к раствору добавляют каприловую кислоту (1,5-3,0 г на 100 мл раствора). Полученную смесь центрифугируют при 2000-10000 g в течение 10-40 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант подвергают диализу против забуференного физиологического раствора -3ФР- (хлорид натрия 8 г, фосфат натрия двухзамещенный 2,9 г, фосфат калия однозамещенного 0,2 г, хлорид калия 0,2 г и дистиллированной воды до 100 мл, рН 7,0-7,4) для доведения рН раствора до 6,8-7,4. Таким образом, заявленный способ позволяет получить конечный продукт без дополнительных стадий очистки (ионообменная хроматография, гель-фильтрация) и исключает применение больших объемов экологически опасных веществ.

П р и м е р 1. К 40 мл донорской плазмы крови человека (концентрация общ. белка С_б 60 мг/мл, концентрация ТТР С_ттр 0,125 мг/мл) добавляют 40 мл 0,03 М ацетатного буферного раствора рН 4,0. Смесь при перемешивании нагревают при 65^оС в течение 30 мин. В горячий раствор методом инстилляции добавляют 1,2 г каприловой кислоты (1,5 об.) и перемешивают еще 30 мин. Центрифугирование проводят при 6000g в течение 40 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант подвергают диализу против забуференного физиологического раствора. Объем полученного раствора составляет 42 мл (С_б 0,094 мг/мл, С_ттр 0,08 мг/мл). Выход ТТР 67,2% степень чистоты белка 85,1%
П р и м е р 2. 50 мл кадаверной плазмы крови человека (С_б 71,6 мг/мл, С_ттр 0,195 мг/мл) разводят в 3 раза 0,1 М ацетатным буферным раствором рН 4,6. Смесь нагревают при 75^оС в течение часа и далее при перемешивании в горячий раствор добавляют 4,5 г каприловой кислоты (1,5 об.). Полученную смесь перемешивают еще 30 мин и центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. Преципитат отбрасывают, а супернатант обрабатывают, против забуференного физиологического раствора. Объем супернатанта составляет 100 мл (С_б 0,1 мг/мл, С_ттр 0,08 мг/мл). Выход ТТР 82,05% степень чистоты 80%
Заявленный способ обеспечивает повышение чистоты и увеличение выхода конечного белка, позволяет значительно упростить и удешевить процесс получения ТТР.

Полученный предлагаемым способом ТТР является антигенным материалом, который можно применять в прикладной иммунохимической практике, например, в качестве:
антигена для иммунизации животных с целью получения моноспецифической антисыворотки и создания тест-системы к данному белку;
стандарта при количественном анализе ТТР в сыворотках доноров и больных при различных патологических состояниях методом радиальной иммунодиффузии и ракетным иммуноэлектрофорезом;
в биохимической практике для идентификации ТТР.

Изобретение относится к медицине и позволяет повысить выход, увеличить степень чистоты транстиретина человека наряду с упрощением и удешевлением способа его выделения. Это достигается осаждением балластных белков из плазмы крови человека или кадавера каприловой кислотой при нагревании в условиях оптимального рН, молярности буферного раствора и времени проведения реакции.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСТИРЕТИНА ЧЕЛОВЕКА из крови путем экстракции, перемешивания, диализа с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют плазму крови и дополнительно кадаверную кровь, экстракцию осуществляют ацетатным буферным раствором pH 4,0-4,5, при перемешивании нагревают в течение 30-60 мин при 65-75^oС, добавляют 1,5 об. капииловой кислоты, повторно перемешивают, перед диализом центрифугируют и собирают диализат, содержащий целевой продукт.