ПЕПТИДСОДЕРЖАЩАЯ ФРАКЦИЯ ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ОБЛАДАЮЩАЯ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1995 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к области иммунологии, иммунофармакологии и может быть использовано в медицине, ветеринарии, реанимации, интенсивной терапии.

В настоящее время одной из сложных задач в области реанимации и интенсивной терапии остается адекватная иммуномодулирующая терапия при генерализованных инфекционных процессах (сепсис и гнойно-резорбтивная лихорадка), летальность при которых, не смотря на применение современных антибактериальных, иммуномодулирующих и дезъинтоксикационных средств остается довольно высокой.

В первую очередь это связано с возникновением, по мере прогрессирования заболевания, различных дефектов в системе иммунитета. Известно, что при генерализованных инфекционных процессах регистрируются нарушения со стороны практически всех звеньев иммунной системы: дефекты гуморального и клеточного неспецифического звена, дефекты Т- и В-систем иммунитета, а также нарушения механизмов иммунорегуляции. Такое комбинированное поражение иммунной системы делает организм практически беззащитным не только к патогенным, но и к условно патогенным микроорганизмам. Поэтому одним из основных патогенетических принципов терапии генерализованных инфекционных процессов остается адекватная иммуностимулирующая терапия.

В настоящее время известен широкий круг средств, являющихся гормонами или медиаторами иммунной системы, обладающих иммуностимулирующей активностью: тактивин, тимопентин, тимоген (препараты, полученные из центрального органа иммуногенеза тимуса), интерлейкины 1 и 2, препараты группы интерферона; миелопиды (препараты из костного мозга); препараты, содержащие иммуноглобулины; а также широкий круг средств, неявляющихся гормонами или медиаторами иммунной системы:
А. Препараты липополисахаридного происхождения: продигиозан, пирогенал, зимозан, пропермил и др.

В. Производимые пуринов и перимидинов: оксиметацил, пентосил, метилурацил и др.

С. Производные 8-оксихинолина: левамизол, диуцифон и др. а также другие средства, не входящие в данные группы; унитиол, изопринозин, нуклеинат натрия, взвесь или экстракт плаценты для инъекций, лейкоген и др.

Однако известные средства обладают низкой терапевтической активностью (иммуностимулирующий эффект проявляется не сразу после приема препарата, а спустя некоторое время до одной недели и более), а также узким спектром иммуностимулирующей активности.

Известно средство, обладающее иммуностимулирующей активностью спленин, представляющее собой безбелковый экстракт из селезенки крупного рогатого скота. Как и другие известные средства спленин не обладает широким спектром иммуностимулирующей активности (стимулирует преимущественно количественные и в меньшей степени качественные показатели В-системы иммунитета, а также обладает умеренным тимомиметическим эффектом).

Кроме того, его иммуностимулирующий эффект проявляется не сразу после введения, а только лишь на 8-10 сутки и более ежедневных инъекций, даже если препарат вводится внутривенно.

В научно-технической литературе описана возможность получения биологически активных веществ селезенки (4).

Существенным недостатком известного способа является то, что получаемый препарат содержит в весьма малом количестве биологически активные вещества белковой природы, а кроме того, препарат непостоянен по составу, плохо хранится (в течение недели при 4-6^оС) и содержит значительное количество примесей.

Прототипом предложения является способ получения иммуностимулятора пептидной природы из селезенки млекопитающих.

Согласно этому способу селезенку свиньи или крупного рогатого скота промывают водой или ацетоном, измельчают, замораживают при -5^оС, экстрагируют 3% уксусной кислотой при рН 3,0-4,0 в присутствии хлористого цинка, центрифугируют, перемешивают с ацетоном, собирают осадок, растворяют водой в присутствии уксусной кислоты с последующей фильтрацией и лиофилизацией целевого продукта.

Однако препарат, получаемый по известному способу, представляет собой комплекс полипептидов, который не обладает высокой стимулирующей активностью и имеет значительное количество примесей.

Автором поставлена задача по получению препарата с широким спектром иммуностимулирующей активности и незначительным временем проявления эффекта от начала его применения.

Способ получения препарата полиактивин Х-210 осуществляют следующим образом.

Селезенку свиньи, крупного рогатого скота обрабатывают физиологическим раствором с гепарином, освобождают от остатков жировой и соединительной ткани, измельчают замораживают при -85^оС и гомогенизируют в 50 мл раствора фосфатного буфера при рН 7,5. Затем рН гомогената доводят до 8,0, экстрагируют этим же раствором, центрифугируют, недосадочную жидкость фильтруют, фильтрат подвергают ультрафильтрации, сорбции и элюции 60 мм раствором фосфатного буфера, элюат подвергают жидкостной хроматографии высокого давления и целевой продукт элюируют 0,01 м раствором фосфатного буфера, содержащим 0,01 м хлористый натрий, полученную фракцию разбавляют физиологическим раствором до конечной концентрации белка в растворе 20 мг/м, затем проводят стерилизующую фильтрацию, разливают в ампулы по 5-10 мм и лиофилизируют.

Способ иллюстрируется следующим образом.

У обездвиженной электрошоком свиньи, в стерильных условиях вскрывают брюшную полость, мобилизуют селезеночные ворота и выделяют селезенку. В стерильных условиях канюлируют селезеночные артерии и вены и промывают сосудистое русло стерильным физиологическим раствором с гепарином (для обработки одной селезенки используют 1000 мл физиологического раствора с добавлением 1000 ЕД гепарина). Отмытую селезенку освобождают от капсулы, остатков жировой и соединительной ткани, помещают в стерильный термос, заливают охлажденным до +5^оС стерильным физиологическим раствором хлористого натрия и транспортируют в лабораторию. В лаборатории селезеночную паренхиму измельчают ножницами до размеров 1,0х1,0х1,0 см, размещают на алюминиевых листах в один ряд и помещают в морозильную камеру, где селезеночную паренхиму замораживают до -85^оС (в таком виде исходный материал можно хранить в течение 5 суток). Замороженную селезенку помещают в гомогенизатор, добавляют 2-3 объема холодного (+4-5^оС) 50 мм фосфатного буферного раствора (рН 7,5) из расчета на 1,0 г ткани. Смесь гомогенизируют в течении 1 минуты. Гомогенизацию повторяют, если остались куски неразрушенной ткани. Гомогенат помещают в вертикальный варочный аппарат ВВМ-50 и доводят рН гомогената до 8,0 1,0 М фосфатным буферным раствором после чего производят экстракцию в течении 15-20 минут при температуре +5 +8^оС. Экстракт центрифугируют при 50000 в течение 60 минут при температуре +2^оС сливают через фильтр марлю или стеклянную вату для удаления частиц жира. Экстракт подвергают концентрации и обессоливанию с помощью ультрафильтрации. С этой целью применяют систему для ультрафильтрации Минатан (Millipore Corporatricn, Bedford, МА 10170), используя мембраны с номенальным пределом молекулярного веса 150000. Время обработки до 50 литров исходного экстракта 3 часа. Все процедуры проводят в холодной (+2 +4^оС) комнате. Для осаждения белка к 1000 мл исходного экстракта добавляют 100 см³ адсорбента (в качестве адсорбента используют гель фосфата-кальция). Осаждение ведут при постоянном перемешивании раствора при температуре +4 +6^оС. После осаждения раствор центрифугируют в течении 15 минут при 50000 g. Основную часть надосадочной жидкости декантируют. Далее 1 часть полученной суспензии промывают на ультрафильтрационной ячейке двумя частями 5 мМ фосфатного буфера с рН 7,5 и отсасывают жидкость вакуумом до получения сухого адсорбента. Затем сухой адсорбент суспендируют в элюирующем растворе (60 мМ фосфатный буферный раствор с рН 7,5 (две части буферного раствора на 1 часть адсорбента (объем/вес). Из полученного раствора белка выделяют пептидную фракцию с М.В. 10000-140000 дальтон с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. В наших исследованиях применяется система для крупно масштабной хроматографии высокого давления (Biolroeess System, Phormecia, Sweden, order 44-00070) со средой для разделения ЗетаПерп, изготавляемая этой же фирмой. Для идентификации белков по молекулярной массе колонки предварительно калибруют рибонуклеазой А и человеческим иммуноглобулином G. В качестве элюента используют 0,01 М фосфатный буфер с добавлением 0,01 М натрия хлорида. Регистрацию проводят по УФ поглощению при длине волны 280 нм.

Пептидную фракцию разбавляют стерильным физиологическим раствором хлористого натрия (0,9%) до концентрации белка в растворе 20 мг/мл. Затем целевой продукт подвергают стерилизующей фильтрации на мембранах Amicon или Владипор с диаметром пор 0,4 нм разливают в ампулы (флаконы) и лиофилизируют. Порошок препарата имеет белый цвет со слабым желтоватым оттенком, без запаха и гигроскопичный. Константа хроматографической подвижности препарата равна 2,16±0,28.

Проведение испытаний на подлинность.

Ампулу препарата, содержащую 40 мг белка (биуретовый метод) разводят 4,0 мл водного буфера и наносят 0,1 мл на стальную колонку, предварительно промытую водным буфером до постоянной базовой линии. Разделение проводят методом высоко эффективной жидкостной хроматографии при скорости элюирующего потока 1,0 мл/мин. Колонку предварительно калибруют голубым декстраном и рибонуклеазой. Выходящие пики детектируют при длине волны 280 нм. На хроматограмме обнаруживают несколько пиков: 1-й со временем удержания от 8,5 до 9,5 мин идентифицируется как голубой декстран: 2-ая группа пиков с временем удержания от 12,8 до 14,5 мин идентифицирована как пептиды, определяющие биологическую активность препарата, 3-й со временем удержания от 16,9 до 18,4 мин идентифицирована как рибонуклеаза. Рассчитывают константу хроматографической подвижности пептидов, определяющих биологическую активность препарата (К), которую вычисляют по формуле:
K где Т_р время удержания рибонуклеазы А;
Т_д время удержания голубого декстрана;
Т время удержания пика.

Константа хроматографической подвижности пептидов, определяющих биологическую активность препарата равна 2,16± 0,28.

Испытание на специфические примеси.

Контроль на отсутствие пептидов с молекулярной массой более 100000 дальтон.

Содержимое ампулы растворяют в 5 мл буфера для элюции и 1,0 мл раствора наносят на хроматографическую колонку диаметром 18 мм и высотой 500 мм, заполненную сефадексом G150. Скорость элюции 2,2 мл за 10 минут. Регистрацию проводят по УФ поглощению при длине волны 280 нм.

На хроматограмме не должно быть пиков УФ поглощаемого материала в области выхода свободного объема колонки (область элюции веществ с молекулярной массой более 100000 дальтон). Для определения области выхода свободного объема хроматографическую колонку предварительно калибруют, нанося на нее смесь 0,5 мл 0,05% раствора голубого декстрана (мол.масса 43000 дальтон) в буфере для элюции.

Примечание: Приготовление элюирующего буфера 0,2 г хлористого натрия) марка ХЧ) растворяют в 0,25 л дистиллированной воды и добавляют 0,05 г азида натрия (марка ОСЧ).

Определение содержания свободных аминокислот.

Содержимое флакона или ампулы растворяют в 10,0 мл дистиллированной воды. К 0,01 мл приготовленного раствора прибавляют 1 мл цитратного буфера рН 2,2 и 200 мкл полученной смеси наносят на колонку аминокислотного анализатора. Аминокислотный анализ проводят стандартным методом. Содержание свободных аминокислот препарат не должно превышать 10 мг.

Определение биологической активности.

Проведение испытания.

У 2-3 половозрелых белых мышей забирают 5 мл крови в пробирку и гепаринизируют 5 ед/мл, седиментируют 60 мин при 20^оС. Супернатант центрифугируют 5 мин при 400 g (4^оС). Клеточный осадок ресуспендируют в 0,5 мл р-ре Хенкса, добавляют 12 мл дистиллированной воды, и через 25 сек. добавляют 4 мл 3,6% физраствора натрия хлорида. Затем центрифугируют (400 g 4^оС, 5 мин) клеточный осадок ресуспендируют в р-ре Хенкса до концентрации клеток 2,5х10⁴ кл/мл. Каждую порцию клеток разделяют на две и помещают в стинтиляционные флаконы (по 1 мл приготовленной суспензии). В два опытных сцинтиляционных флакона добавляют по 1 мл приготовленного раствора полиактивина, в два контрольных флакона по 1 мл раствора Хепес. Опытные и контрольные флаконы адаптируют 30 мин при 37^оС пр актиничном свете. Последовательно добавляют в каждый флакон по 20 мкл матричного раствора люминола, осторожно перемешивают 30 сек. вращая флакон и помещают его в счетчик. Во флаконах последовательно регистрируют уровень хемилюминесценции (1 минута счет) тремя активированными трубками в режиме совпадения.

После подсчета контрольных и опытных проб вычисляют коэффициент прироста хемилюминесценции по формуле:
K , где 01, 02 интенсивность хемилюминесценции в опыте;
К1, К2 интенсивность хемилюминесценции в контроле.

Коэффициент прироста хемилюсценции (К) не должен быть меньше 4.

Автором экспериментальным путем установлено, что значительно большей иммуностимулирующей активностью обладает именно пептидная фракция экстракта селезенки (предлагаемое средство), чем безбелковая спленин. С другой стороны, из литературных данных известно, что пептиды различных животных обладают видовой специфичностью, то есть при многократном введении в генетичности чужеродный организм развивается сенсибилизация, которая может протекать в основном по первому, второму, третьему или четвертому типу иммунопатологических реакций (согласно классификации Gell et R.A. Coombs) (6). Поэтому проведены эксперименты по определению той части белкового экстракта, которая не обладает видовой специфичностью. Для этого грубый экстракт селезенки разделили с помощью гельфильтрации на сафадексе на фракции с молекулярной массой до 10000, 10000-20000, 10000-30000, и так далее до фракции 10000 250000 дальтон. Затем данными фракциями сенсибилизировали лабораторных животных: беспородных белых мышей, белых крыс, кроликов породы Шиншилла, беспородных собак. Для выявления первого типа иммунопатологических реакций использовали определение уровня гистамина периферической крови и классический тест воспроизведения анафилаксии после введения разрешающей дозы пептида парэнтерально. Для выявления второго типа иммунопатологических реакций после окончания сенсибилизации ставили тесты потребления комплемента, антителозависимой клеточной цитотоксичности, а также иммунопреципитацию в агаре. Для выявления третьего типа иммунопатологических реакций использовали определение иммунных комплексов, связывающих комплемент, определили их размер, а также активность комплемента и концентрацию продуктов деградации компонентов комплемента С-3 и С-4. Для выявления четвертого типа иммунопатологических реакций использовали реакции торможения миграции макрофагов и реакцию бласттрансформации в присутствии специфического антигена.

Отмечено, что при введении всем лабораторным животным фракций, начиная с фракции 150000 дальтон и кончая фракцией 250000 при повторном введении развивается иммунопатологическая реакция по первому типа (анафилактический шок) почти у 100% животных. Таким образом, данные фракции были сразу исключены из дальнейших исследований. При введении остальных исследуемых фракций с молекулярной массой менее 140000 дальтон отметили только в одном случае анафилактический шок, при дальнейшем исследовании данных фракций анафилактического шока не возникло, поэтому этот один случай был расценен вами как артефакт. Развитие же других типов иммунопатологических реакций (второго, третьего и четвертого типов) не наблюдали вообще.

Для оценки спектра иммуностимулирующей активности и времени его развития (оценивали по нормализации иммунологических показателей) использовали определение иммунного статуса белых беспородных мышей с перитонитом (вызывали введением внутрибрюшинно культуры золотистого стафилококка) через 30 минутные интервалы после однократной инъекции исследуемых фракций) необладающих сенсибилизирующей активностью). Количество вводимого вещества в пересчете на белок было равным во всех исследуемых фракциях. Иммунный статус оценивали по следующим показателям: количество Т, В, Д, О-лимфоцитов, Т хелперов, Т супрессоров, реакция бласттрансформации с фитогемагглютинином, количество иммуноглобулинов классов А, М и G фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и индекс бактерицидности нейтрофилов; активность комплемента сыворотки; концентрация циркулирующих иммунных комплексов и среднемолекулярных пептидов.

В результате проведенных исследований отмечали нормализацию всех измененных показателей после однократной инъекции исследуемых фракций с молекулярной массой до 140000 дальтон. Как видно из табл.1 наибольшей иммуностимулирующей активностью обладала фракция с молекулярным весом 10000 140000 дальтон, время нормализации показателей при применении данной фракции также было минимальным (в среднем 1,0-1,5 часа), при применении фракции с молекулярным весом менее 10000 дальтон время нормализации показателей было применено таким же как у спленина.

П р и м е р. Использовали иммуномодуляцию в комплексном лечении собак с сепсисом (54 штуки) с применением спленина и предложенного средства. Сепсис вызывали двухкратным внутривенным введением культуры золотистого стафилококка ВУД-46 по 10 миллионов микробов с интервалом в 2 дня. На четвертые сутки после последней инъекции состояние собак было тяжелым, из крови высевалось до 130-160 микробных колоний. Клинически регистрировали выраженную адинамию, сухость слизистых покровов, одышку, тахикардию и гипотонию. У обеих групп собак лечение было начато на 5 сутки после последней инъекции микробов. У обеих групп собак применяли одинаковую антибактериальную терапию, дезинтоксикационную и парэнтеральное питание; коррекцию водно-электролитного обмена и лечение ДВС-синдрома. Иммуномодуляцию в 1 группе собак осуществляли введением по 5 мл ежедневно внутримышечно предложенного средства, во 2-й группе по 5 мл спленина. Показатели иммунитета оценивали до начала терапии, через сутки и через 5 суток после начала лечения. К концу 5-х суток во второй группе осталось в живых только 6 собак; в первой группе по истечении 5-ти суток умерла только одна собака. Клинически в первой группе поведение животных не отличалось от здоровых особей, собаки были активны, питались самостоятельно; при бакпосеве кровь этих собак была стерильной. Во второй группе состояние собак было средней тяжести, клинически наблюдалась адинамия, собаки самостоятельно не питались, из крови высевалось по 20-45 колоний микробов.

В первой группе собак лечение было прекращено по истечении 5-ти дневной терапии, во второй продолжалось. По истечении 14 суток в первой группе все собаки были живы, во второй группе последняя собака умерла на 14 сутки.

Динамика иммунологических показателей представлена в таблице 2.

Как видно из таблицы до начала терапии у собак отмечается резкое снижение количества Т-лимфоцитов в основном за счет снижения Т-хелперов, резкое снижение РБТЛ с лимфоцитарным митогеном, уменьшение содержания иммуноглобулинов М и G, снижение фагоцитарного числа и индекса бактерицидности нейтрофилов, высокое содержание циркулирующих иммунных комплексов.

Таким образом, отмечены дефекты со стороны качественных и количественных показателей Т-системы иммунитета, качественных показателей В системы иммунитета, а также показателей фагоцитоза. В первой группе собак после первых суток терапии практически все исследуемые показатели достоверно от контрольных значений не отличались, во второй группе оставались достоверно сниженными общее количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов, иммуноглобулинов М и G, РБТЛ, а также показатели фагоцитоза и концентрация ЦИК.

По истечении 5-ти суток в первой группе собак некоторые показатели даже превышали контрольный уровень. Во второй группе собак по истечении 5-ти суток терапии показатели существенно не отличились от их абсолютных значений после первых суток терапии.

Таким образом, применение для иммуностимуляции предложенного средства дает более выраженный и быстрый иммуностимулирующий эффект, что существенно сказывается на эффективности комплексной терапии.

Предложенное средство для иммуностимуляции, также, апробировано в комплексном лечении 109 собак с чумкой и 98 собак с вирусным энтеритом. Собак брали на лечение после того, как они выбраковывались ветврачом в плане неэффективности дальнейшего лечения. При применении заявляемого средства из 109 собак с чумкой погибло 7 собак (летальность 6,4%), из 98 собак с энтеритом только одна (летальность 1%), что свидетельствует о высокой терапевтической активности препарата.

Предлагаемое средство может быть использовано для коррекции иммунодефицитных состояний различной этиологии, а также как компонент терапии тяжелых форм гнойно-сеатической инфекции любой этиологии в ветеринарии и медицине.

Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии, а точнее в области клинической иммунологии, иммунофармакологии, интенсивной терапии. С целью быстрой и эффективной стимуляции иммунитета при комбинированных поражениях иммунной системы применяют пептидсодержащую фракцию экстракта селезенки с молекулярной массой 10000 - 140000 дальтон. Полученный по изобретению иммуностимулятор дает четко выраженный и быстрый иммуностимулирующий эффект. 2 табл.

1. Пептидсодержащая фракция из селезенки млекопитающих мол.м.10000 - 140000 Д, обладающая иммуностимулирующей активностью. 2. Способ получения пептидсодержащей фракции из селезенки млекопитающих, включающий промывание органа, измельчение, замораживание, экстрагирование, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что селезенку промывают физиологическим раствором, после замораживания гомогенизируют в растворе 50 мМ фосфатного буфера, гомогенат экстрагируют раствором 1,0 М фосфатного буфера, после центрифугирования надосадочную жидкость подвергают ультрафильтрации, сорбции на гельфосфате кальция, обработке сорбента раствором 60 мМ фосфатного буфера с последующей жидкостной хроматографией и элюцией целевого продукта раствором 0,01 М фосфатного буфера.