СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 G01N33/555 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано в клинической практике.

Известен способ диагностики энтеровирусных инфекций, основанный на реакции связывания комплемента (РСК). На первом этапе в реакцию вступают антиген и антитело, а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антител образовавшийся иммунный комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью гемолитической системы. При связывании комплемента лизиса эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК несвязанный комплемент вызывает гемолиз, по степени которого судят о результатах реакции.

Однако данный способ подразумевает длительную обработку исследуемого материала для выделения антигенов, не предусматривает инструментального учета результатов, а его применение затруднено из-за большого числа серологических типов энтеровирусов.

Цель изобретения ускорить способ диагностики энтеровирусных инфекций, а также повысить его чувствительность и стабильность.

Способ осуществляют следующим образом.

Во флакон с фекалиями, поступившими от больного, вносят 10 мл жидкой питательной среды 199, затем 0,05 г стрептомицина сульфата и 100 тыс. бензилпенициллиновой натриевой соли. Смесь помещают в аппарат УВМИ-12-50 при 38^оС на 35-40 мин. Благоприятный температурный режим и постоянное покачивание испытуемого материала в аппарате в наибольшей степени способствуют высвобождению пикорнавирусов из фекалий. Через указанный промежуток времени испытуемую пробу центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин для удаления наиболее грубых частиц фекалий. Надосадочную жидкость отсасывают без соблюдения правил стерильности, но с соблюдением правил асептики.

В чистую пробирку для осветления исследуемого материала вносят надосадок и производят повторное центрифугирование при 3000 об./мин в течение 15 мин.

I этап исследования.

Надосадочную жидкость в объеме 0,015 мл соединяют с равным объемом поливалентных иммунных сывороток к вирусам Коксаки В 1-6, Экхо 7-13, Экхо 14-24, Экхо 25-32, а также вирусу полиомиелита I-III типа и вирусов Коксаки А в разведении 1:10. К полученным смесям добавляют 0,1 мл четырех гемолизирующих доз комплемента и помещают в термостат при 37^оС на 60 мин. Далее к выдержанным в термостате смесям добавляют 0,2 мл гемолитической системы, состоящей из 0,5% эритроцитов барана и 10 гемолизирующих доз стандартной гемолитической сыворотки, смешанных ex tempora в равных объемах. Контролями служат обработанные фекалии с добавлением вместо иммунных сывороток стандартного вероналовомединалового буфера, а также иммунные сыворотки без внесенного исследуемого материала, который заменен на указанный буфер, и контроль комплемента без сывороток и исследуемого материала. Смеси после внесения гемолитической системы помещают в водяную баню при 39-40^оС и выдерживают в течение 10-20 мин до появления видимого гемолиза в контролях. Затем в условиях комнатной температуры во все пробы добавляют по 0,5 мл смеси, включающей равные объемы 3%-ной перекиси водорода и 0,1%-ного раствора ортофенилендиамина. Через 30-60 с во все исследуемые пробы для остановки реакции добавляют по 1 мл 1 н.раствора Н₂О₄. Интенсивность розово-коричневого окрашивания проб количественно измеряют на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Наличие энтеровируса определенного сероподтипа оценивают по двухкратному и более снижению уровня экстинции интенсивности окрашивания по сравнению со средним значением показателей контролей иммунной сыворотки и обследуемого материала. На данном этапе исследования подтверждается наличие в обследуемом материале энтеровирусного антигена, относящегося к одной из групп, соответствующей используемым сывороткам.

II этап исследования.

Для точного выявления сероподтипа энтеровируса, обнаруживаемого на первом этапе исследования, поливалентные сыворотки заменяют на моновалентные, относящиеся к той подгруппе, в которой на первом этапе исследования получены положительные результаты. Методически второй этап не отличается от первого. Учет типа выявляемого антигена на данном этапе исследования проводят по пробе той моновалентной сыворотки, которая в смеси с исследуемым материалом дает наименьший уровень экстинции по отношению к контролям и остальным моносывороткам этой подгруппы.

П р и м е р 1. Больной Б.С. (ист.бол. N 189), 8 лет, поступивший в клинику ЛНИИДИ с первичным диагнозом менингит 13.11.1990 г. На обследование взяты фекалии больного, полученные на третий день после госпитализации. Материал исследуют как описано выше. По разрабатываемому способу. Ответ был получен 20.11.1990.

Протокол исследования:
I этап исследования.

По результатам, полученным на I этапе, выявлен энтеровирусный антиген, относящийся к группе Экхо 14-24.

II этап исследования.

По данным II этапа исследования в обследуемом материале обнаружен антиген энтеровируса Экхо-20. Общее время обследования по двум этапам составляет 4 ч 35 мин.

П р и м е р 2. Больной В. (ист.бол. N 237), 13 лет, поступил в клинику ЛНИИДИ с первичным диагнозом: серозный менингит, миокардит. На обследование взяты фекалии больного, полученные на 1-й день после госпитализации и 2-й день заболевания. Материал исследуют как описано выше.

Протокол исследования.

I этап исследования.

По результатам, полученным на I этапе, выявлен антиген, относящийся к группе Коксаки В1-6.

II этап исследования.

По данным II этапа исследования в обследуемом материале обнаружен антиген вируса Коксаки В1. Общее время обследования по двум этапам составило немногим более 4 ч.

П р и м е р 3. Больная С. (ист.болезни N 1024), 1 год 8 мес. поступила в клинику ЛНИИДИ с первичным диагнозом полиомиелитоподобное заболевание.

На обследование взяты фекалии больной, полученные на 1 день госпитализации и заболевания. Материал исследуют, как описано выше.

Протокол исследования.

I этап исследования.

По результатам, полученным на 1 этапе, обнаружен антиген, относящийся к группе вирусов полиомиелита.

II этап исследования.

По данным II этапа исследования в обследуемом материале обнаружен антиген вируса полиомиелита II типа. Общее время обследования по двум этапам составляет около 4 ч.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и с высокой чувствительностью выявлять энтеровирусы различных серологических групп. Он может быть использован для индикации антигенов энтеровирусов при обследовании вспышек к энтеровирусных инфекций, дифференцировке этиологии инфекционных заболеваний в неясных случаях, а также при обследовании воды, сточных вод и других экосистем.

Использование: медицинская биотехнология, клиническая вирусология. Сущность изобретения: с целью экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций вирусные антигены выявляют непосредственно в исследуемом материале, который прогревают при постоянном покачивании в течение 35 - 40 мин при 38°С. После этого пробу центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин и затем еще раз при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее ставят реакцию связывания комплемента (РСК) со специфическими сыворотками. Результат реакции учитывают спектрофотометрически по цветовому показателю лизиса эритроцитов в зависимости от уровня освободившейся из них каталазы. 6 табл.

СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ, предусматривающий смешивание выявляемых антигенов со специфическими антителами и комплементом, добавление смеси бараньих эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки и учет результатов по степени лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что специфические антитела смешивают с антигенами, содержащимися в исследуемом материале, который обрабатывают в течение 35 40 мин при 38^oС на роллерной установке с 50 65 колебаниями/мин и затем двукратно центрифугируют, а степень лизиса эритроцитов учитывают спектрофотометрически по цветовому показателю в зависимости от уровня освободившейся из эритроцитов каталазы.