СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ КЛЕЩЕВОГО СИСТЕМНОГО БОРРЕЛИОЗА У ДЕТЕЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, точнее к инфектолологии и предназначено для прогнозирования развития хронического течения клещевого системного боррелиоза (КСБ) у больных в остром периоде инфекции.

КСБ или Лайм-боррелиоз является повсеместно распространенным инфекционным заболеванием, связанным с жизнедеятельностью иксодовых клещей - основных хранителей и переносчиков инфекции, эндемичные очаги которой расположены на всей территории России, включая Ленинградскую область. КСБ отличается стадийностью развития заболевания, которая характеризуется наличием острого периода болезни, протекающего в виде эритемной или общеинфекционной форм (1-я стадия инфекции), либо с развитием нейроборрелиоза и кардиопатии (2-я стадия). Однако при недостаточной антибиотикотерапии заболевание может перейти в хроническую 3-ю стадию, которая проявляется поражением суставов (артриты), кожи (очаговая склеродермия, атрофический акродерматит), сердца (панкардит), нервной системы (энцефаломиелит, энцефалопатия с психопатологическими нарушениями, полирадикулонейропатия).

Острый период заболевания протекает в основном благоприятно и ведет к выздоровлению. Однако наибольшую угрозу для здоровья при заражении боррелиями приобретает хроническая стадия заболевания, поскольку она характеризуется диссеминацией инфекции, трудностями излечения и возможностью последующей инвалидизации. В развитии хронических форм инфекции имеют значение как персистенция возбудителя, что доказано выделением боррелий через 5 и более лет от начала заболевания из кожи, ликвора, синовиальной жидкости пациентов, так и циркулирующие иммунные комплексы, а также аутоиммунные механизмы.

Известны различные способы выявления иммунных комплексов (ИК) как специфических, так и неспецифических у больных при многих инфекционных формах. (Herrmann K., Lohrisch I.et al. Detection of antibodies after immune complex splitting in serum of patients with bullous pemfphigoid and systemic lupus erythematosus//Br. J.Dermatol., 1987, V.99, p.635-40; Dobson S.R.M, Taber L. H., Baughn R.E.Characterization of the components in circulating immune complexes from infants with congenital syphilis// J.Infect.Dis.l988, V.158, p. 940-47). Такие комплексы тестируются также и при КСБ наряду с образованием антител (AT) (Hardin J.A., Steere A.C.,Malawista S.E.// Immune complexes and the evolution of Lyme Arthritis// N.Engl.J.Med.l997, V.301, p. 1358-63; Coyle P.K., Schutzer S.E. et al. Cerebrospinal fluid immune complexes in patients exposed to Borrelia burgdorferi: detection of borrelia-specific and -nonspecific coplexes//Ann. Neurol. , 1990, V.28(6), p.739-44). Чаще всего выделение таких комплексов проводят с помощью этиленгликоля с дальнейшим их расщеплением в зонах pH>10,0 и тестированием затем специфических AT методом ELISA, иммуноблотингом или любым другим тестом.

В то же время, недостатками всех этих методов выявления ИК является следующее: во-первых, обнаружение комплексов не сопровождается характеристикой степени авидности специфических AT в таких комплексах, во-вторых, при лабораторном определении ИК и свободных AT используются хотя и высокочувствительные реакции, но они не могут окончательно охарактеризовать состояние инфекционного процесса на момент обследования.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения ИК при КСБ в серонегативных случаях по выявлению свободных AT (Schutzer S.E. , Koyle P.K., Belman A.L. et al. Sequestrastion of antibody to Borrelia burgdorferi in immune complexes in seronegative Lyme disease // Lancet, 1990, V.335, p.312-15).

Способ основан на осаждении ИК с помощью 7,0% полиэтиленгликоля (м.в. 6000) при pH 8,4 в течение ночи, центрифугирования при 8320g в течение 15 мин с дальнейшим ресуспензированием в боратном буфере при рН 10,2, для диссоциации ИК. Далее наличие специфических AT определялось в иммуноферментном тесте ELISA.

К недостаткам данного способа можно отнести так же, как и для аналогов, отсутствие характеристики авидности при тестировании данного ИК, что может характеризовать в определенной степени тяжесть острого периода КСБ. Другим недостатком способа, описанного в прототипе, является отсутствие выявления роли комплемента (КО) в образовании специфических ИК, так как присутствие в комплексе белков КО должно снижать степень их диссоциации. И наконец, при выполнении прототипного способа отсутствуют возможности прогноза хронизации процесса.

Указанные недостатки устранены в предлагаемом способе прогнозирования КСБ у детей путем определения специфических AT и ИК с целью своевременной коррекции терапии, улучшения исходов заболевания, предотвращения перехода острого течения болезни в хронический.

Поставленные цели достигаются тем, что в сыворотке крови больных определяют одновременно в единой системе реакций концентрацию AT к боррелиям, уровень специфических ИК, содержащих белки КО, а также неспецифических ИК, не содержащих КО, и по наличию в конце острого периода AT менее 0,20 относительных единиц (ОЕ), отсутствию комплементсодержащих специфических ИК и концентрации ИК, не содержащих КО, более 0,40 ОЕ судят о возможном развитии хронических форм КСБ.

Авторы впервые предложили использовать для прогноза развития хронических форм боррелиоза комплексную оценку показателей, определяемых в крови больных в конце острого периода, специфических AT, а также двух типов ИК: специфических, содержащих комплементарные белки и неспецифических, не несущих на себе комплементарных белков и сорбирующих их при дополнительном внесении. Такая суммарная оценка, воспроизводимая заявляемым способом, дает возможность определить у больного состояние специфического иммунитета (по AT), а также способность его иммунной системы к элиминации возбудителя из организма. В случае наличия у больных высокого содержания комплексов, не содержащих КО, естественно, что степень выведения боррелий из организма резко задерживается, так как при отсутствии в ИК комплемента сорбция его на фагоциты (макрофаги, гистиоциты кожи) замедляется. Это создает возможность попадания ИК в другие ткани и органы и развития там патологического процесса, связанного как с ИК, так и с элиминирующимся из этого комплекса возбудителем. С другой стороны, при наличии у больных ИК с сорбированным КО выведение его происходит скорее, что приводит к выздоровлению. Развитие хронического течения КСБ особенно часто происходит у больных, у которых в конце острого периода в крови отсутствуют не только специфические комплементсодержащие ИК, но и свободные AT.

Способ осуществляется следующим образом.

Соединяют (50 мкл) исследуемой сыворотки больного в конце острого периода КСБ и 50 мкл антигена Borrelia burgdorferi в разведении 1:100, добавляют 100 мкл КО (2 гемолитические единицы) и смеси помещают в термостат на 2 часа при +37^oC. Далее к смесям добавляют гемолитическую систему в виде 0,8% взвеси бараньих эритроцитов и 10 доз антибараньей гемолитической сыворотки. Контролями в способе являются: контроль антигена без добавления исследуемой пробы, контроль исследуемой пробы с мединал-вероналовым буфером вместо антигена и контроли комплемента и гемолитической системы без исследуемой пробы и антигена.

После появления гемолиза в контроле исследуемой пробы и контроле гемолитической системы все смеси (опытная и контрольные) центрифугируют при 3000g для осаждения негемолизированных эритроцитов. Далее определяют степень гемолиза по уровню оксидазных ферментов, вышедших в супернатант из гемолизированных эритроцитов. Для этого после центрифугирования в 50 мкл надосадков добавляют 0,08% раствор ортофенилендиамина в 3,0% перекиси водорода, реакцию останавливают через 20 мин 1N H₂SO₄ и определяют величину экстинции цветовой реакции при длине волны 495 нм на иммуноферментном анализаторе любой фирмы.

Результаты такого определения представляют три варианта выявляемых компонентов:
- иммунный комплекс, не содержащий комплемент, определяется по формуле (K_ко-K_ип): K_ко, где K_ко - контроль комплемента; K_ип - контроль исследуемой пробы (величина ИК обозначается при величинах 0,10-1,5 ОЕ);
- специфические антитела определяются по формуле (K_аг- A_оп):K_аг, где K_аг - контроль антигена; A_оп - опытная проба (исследуемая сыворотка + антиген) (в данном определении специфические AT обозначаются при отрицательной величине в пределах - 0,10-1,0 ОЕ);
- иммунный комплекс, содержащий белки комплемента, определяется по предыдущей формуле в случае получения положительной математической величины в пределах от +0,10 до +1,0.

Неблагоприятный прогноз в возможном развитии хронических форм болезни устанавливается предлагаемым способом по следующим параметрам. При наличии в конце острого периода специфических антител в пределах 0,10-0,20 ОЕ или полном их отсутствии в 60% у больных в дальнейшем развиваются повторные обострения в виде появления мигрирующих рецидивирующих эритем, либо прогрессирование заболевания с поражением других органов и систем в виде полирадикулонейропатий, плексопатий, артритов и др. Главным лабораторным показателем прогноза в плане хронизации заболевания оказался уровень комплементсодержащих ИК. Эти комплексы определяются по увеличению комплементарной активности при добавлении к исследуемой сыворотки антигена Borrelia burgdorferi и КО. При такой аранжировке тестирования из ИК с КО выходят отдельные комплементарные белки и усиливают активность добавленного КО. Такие комплементсодержащие комплексы полностью отсутствуют у больных с неблагоприятным прогнозом, но они отмечаются в 63,5% при полном выздоровлении. В то же время, ИК, не содержащие КО и существенно сорбирующие его в пределах > 0,40 ОЕ, встречаются у больных, у которых в процессе диспансеризации диагностированы хронические формы КСБ в 80,0%.

Сумма трех основных параметров: отсутствие комплементсодержащих ИК, наличие комплексов, не содержащих КО, и низкий уровень или отсутствие специфических AT позволяет прогнозировать развитие хронического течения КСБ у детей в 90,0% случаев (см. таблицу).

Из таблицы видно также, что ИК без КО обнаруживаются у 80,0% больных с последующей хронизацией процесса, в то время как комплексы с наличием КО не выявляются ни у одного больного. Комплексы без КО при остром процессе практически также являются специфическими, что четко показано в прототипе. В тоже время, такое различие комплексов в отличие от прототипа характеризует инфекционный процесс, развивающийся у больных на стадии ранней реконвалесценции. Больные, у которых заболевание приобретает хроническое течение, в конце острого периода в крови содержат в основном комплексы, не содержащие КО. Эти комплексы слабоавидны и, как известно, диссоциируют с освобождением возбудителя, с последующей диссеминацией его в тканях. В отличие от этого при полном выздоровлении такие комплексы тестируются с минимальной частотой (в 12,5%), а почти в двух третях случаев у больных выявляются специфические комплексы с присутствием в их структуре комплементарных белков. Становится очевидным, что при полном выздоровлении у больных циркулируют специфические комплексы, блокированные комплементом, что ведет к более ускоренному их выведению из организма за счет сорбции макрофагами и тканевыми фагоцитами.

В то же время, эти два ИК характеризуют некоторые стороны неспецифической резистентности организма. При полном выздоровлении у больных достаточно комплементарных белков, чтобы ассоциироваться с ИК, в то время как недостаток КО приводит к хронизации процесса, в частности за счет снижения афинности образующихся ИК.

С другой стороны, уровень выявляемых AT при последующем развитии хронических форм инфекции несколько ниже, чем у больных с выздоровлением. Минимальные уровни AT в первом случае обнаруживаются у 80,0% больных, в то время как во втором - в 50,0%.

При сравнении всех трех параметров - AT, ИК с КО и ИК без КО очевидно, что более важным для прогноза является уровень последних, так как разница в частоте в пользу хронизации составляет для этого параметра - 67,5%, для ИК с КО она несколько меньше - 62,5%, а для AT она не превышает 30,0%.

Однако для достоверного прогноза необходимо оценивать суммарно все три выявляемых компонента. Так, в конце острого периода КСБ 90,0% больных с последующей хронизацией удовлетворяют необходимым требованиям способа по всем параметрам, в то время как при полном выздоровлении таких больных не было. Среди этих больных по одному параметру выявлялось 79,1%, а по двум 8,3%.

Способ легко выполним, представляет собой единую систему реакций связывания КО с различным уровнем учета по ферментному тестированию и может выполняться в любых вирусологических и серологических лабораториях. Экономическая эффективность метода безусловна, так как не требует специальных дорогостоящих иммуноферментных наборов. Все ингредиенты для реакции (антиген Borrelia burgdorferi, комплемент, бараньи эритроциты, гемолитическая сыворотка и ортофенилендиамин) высокой стоимости не имеют.

Описанный способ прогнозирования можно проиллюстрировать на конкретных примерах: в 1-ом случае при развитии хронического течения заболевания, во 2-ом - в случае выздоровления.

Пример 1. Больной Петя В., 8 лет. Ист.б. N1792, диагноз: КСБ - 1-я стадия, эритемная форма. Ист.б. N2920, диагноз: КСБ - 3-я стадия, распространенная полирадикулонейропатия с вегетативными и чувствительными нарушениями, хроническое течение.

Из анамнеза известно, что укушен клещом 07.05.95 г. в правую заушную область в п.Капралово Пушкинского района Ленинградской области. 18.05.95 г. (через 11 дней) у ребенка поднялась температура до 39^oC, появилась слабость, снижение аппетита, эритема в месте присасывания клеща. Госпитализирован в НИИ детских инфекций на 2-ой день болезни.

При поступлении у больного обнаружена кольцевидная эритема правой околоушной области диаметром 15 см с отечностью мягких тканей, сопровождающаяся болезненностью и зудом, увеличение заднешейных, затылочных лимфоузлов, симптомы интоксикации. В анализе крови от 20.05.95 - специфических AT, СИК с КО+ не обнаружено, уровень ИК без КО - составил 0,59 ОЕ. Диагноз был поставлен на основании эпидемиологических данных (сведений об укусе клеща), а также типичной клинической картины заболевания (кольцевидная эритема, регионарный лимфаденит). Назначена антибиотикотерапия - эритромицин по 0,25 г 4 раза в сутки в течение 10 дней. На фоне проводимой терапии лихорадка сохранялась 3 дня, эритема исчезла на 6 сутки лечения. При ЭКГ обследовании от 20.05.95 г. (3-й день болезни) выявлены легкие нарушения реполяризации, от 31.05.95 г. - без отклонений от нормы.

К моменту выписки из стационара 01.06.95 г. у пациента сохранялся умеренный регионарный лимфаденит, остальные клинические симптомы заболевания регрессировали. В анализе крови от 31.06.95 г. (14 день болезни) специфические AT и СИК с КО+ отсутствуют, уровень ИК без КО - составил 0,70 ОЕ.

С 09.95 г (через 4 месяца от начала заболевания) у мальчика появились боли области подколенных и локтевых ямок, усиливающиеся при физической нагрузке, которые беспокоили в течение месяца, затем наступила ремиссия. С 04.96 г. (через 11 мес от начала заболевания) боли возобновились, усилились, появились ощущения замерзания, зябкости ног, что привело к необходимости повторной госпитализации в клинику нейроинфекций НИИДИ. При поступлении выявлены выраженные вегетативные нарушения (гипергидроз и гипотермия ладоней и стоп), нарушения поверхностной чувствительности (болевой и температурной) по полиневритическому типу. Гиперрефлексия, симптомы натяжения нервных стволов. При электронейромиографии от 15.04.96 г. наблюдалось снижение скорости проведения импульса и амплитуды потенциала преимущественно чувствительных нервов, что свидетельствует об аксональном характере поражения. При тепловизионном обследовании выявлена гипотермия стоп и кистей. В анализе крови от 14.04.96 г. специфические AT отсутствуют, уровень СИК с КО+ составил 0,34 ОЕ, уровень ИК без КО - 0,88 ОЕ. На основании клинической картины, функциональных и лабораторных методов исследования ребенку поставлен диагноз: КСБ - 3-я стадия, распространенная полирадикулонейропатия с вегетативными и чувствительными нарушениями, хроническое течение. Больной получил повторный курс антибиотикотерапии - зинацеф из расчета 80 тыс. на кг массы тела в течение 21 дня, сосудистые препараты, витамины.

Пример 2. Больной Владимир Н., 12 лет. Ист.б. N3457, диагноз: КСБ - 1 стадия, эритемная форма.

Из анамнеза известно, что укушен клещом в межлопаточную область 12.07.96 г. в п.Лемболово Всеволожского района Ленинградской области. Клещ обнаружен и удален родителями только на 10 день присасывания. С 23.07.96 г. в месте укуса клеща появилась эритема на фоне нормальной температуры. Госпитализирован в НИИ детских инфекций на 2-ой день болезни. При поступлении у больного обнаружена в межлопаточной области, с распространением на правую лопатку, кольцевидная эритема диаметром 12 см с бледным центром и отечными гиперемированными краями, увеличение преимущественно правых подмышечных лимфоузлов до 2 см. На ЭКГ обследовании от 25.07.96 г. (на 3-й день болезни) и от 06.08.96 г. (на 15 день болезни) отклонений от возрастной нормы не выявлено. В анализе крови от 24.07.96 г. специфических AT и ИК без КО - не выявлено, СИК с КО+ составили 0,33 ОЕ. Больной получал зиннат по 500 мг 2 раза в день в течение 14 дней. Эритема исчезла на 3-й день терапии, уменьшились лимфоузлы. В анализе крови от 06.08.96 г. (на 16 день болезни) - СИК с КО+ и ИК без КО - отсутствовали, уровень специфических AT составил 0,34 ОЕ. В течение двухлетнего катамнестического наблюдения за больным с повторными лабораторными обследованиями данных, свидетельствующих о переходе заболевания в хроническую стадию, не получено.

Использование предложенных лабораторных критериев а также результатов длительного в течение двух-трех лет наблюдения за 150 больными, перенесшими острую стадию заболевания в возрасте от 3 месяцев до 15 лет, позволило выявить достоверную коррелятивную зависимость этих данных и диагностировать хронические формы заболевания у 27 больных.

Предлагаемый способ прогнозирования развития хронического течения КСБ позволяет еще в остром периоде инфекции выявить возможность неблагоприятного течения боррелиоза у детей и своевременно провести коррекцию терапии.

Накопленный опыт по лечению КСБ у детей показал высокую терапевтическую эффективность таких антибиотиков как пенициллин, доксициклин, цефуроксим и др. препаратов цефалоспоринового ряда, применение которых приводит к санации организма от боррелий. Использование данного способа прогнозирования в течение 3-х лет позволило добиться снижения развития хронических форм боррелиоза, которые в 1995 г. составили 20,0%, в 1996 г. - 18,0%, тогда как в 1997 г. - 11,0%, что свидетельствует об эффективности способа как в социальном, так и в экономическом плане.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам прогнозирования развития хронических форм клещевого системного боррелиоза у детей, и может быть использовано в клинической практике. Сущность изобретения: в сыворотке крови больных определяют одновременно в единой системе реакции концентрацию антител к боррелиям, уровень специфических иммунных комплексов и неспецифических иммунных комплексов, не содержащих комплемента, и по наличию в конце острого периода антител менее 0,20 OЕ, отсутствию комплементсодержащих специфических иммунных комплексов и концентрации иммунных комплексов, не содержащих комплемента, более 0,40 ОЕ судят о развитии хронических форм клещевого системного боррелиоза. Технический результат состоит в улучшении исходов заболевания и предотвращении перехода острого течения болезни в хроническое. В результате применения данного способа прогнозирования удалось улучшить исходы заболевания и уменьшить переход в хронические формы с 20-18% в 95-96 гг. до 11% в 97г. 1 табл.

Способ прогнозирования хронического течения клещевого системного боррелиоза у детей путем определения специфических антител и иммунных комплексов, отличающийся тем, что в сыворотке крови больных определяют одновременно в единой системе реакций концентрацию антител к боррелиям, уровень специфических иммунных комплексов и неспецифических иммунных комплексов, не содержащих комплемента, и по наличию в конце острого периода антител менее 0,20 относительных единиц, отсутствию комплементсодержащих специфических иммунных комплексов и концентрации иммунных комплексов, не содержащих комплемента, более 0,40 относительных единиц судят о развитии хронических форм клещевого системного боррелиоза.