СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ДНК-ВЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике вирусных инфекций. Цитомегаловирусная, герпетическая инфекция, а также вирусные заболевания, вызываемые вирусом Эпштейн-Барра, относятся к группе герпетических инфекций, постоянно персистирующих в организме человека от момента инфицирования (Kuwert E. Marcus J. "Herpesprobleme aus vergleichend medizischer Sicht "Berlin und Munch tierazztl. Wochenschr., 1986, 99, N 12, s.40-405). Активация этих вирусов происходит в различные периоды c поражением ЦНС и других важных органов и систем и особенно в раннем детском возрасте. Более реже это происходит у взрослых при резком снижении иммунитета, например при заболевании острыми вирусными инфекциями, блокирующими иммунную систему организма (грипп, СПИД) или при пересадке органов и тканей. В ряде случаев активация ДНК-вых инфекций с его репродукцией может происходить вне связи и развитием характерных для каждого возбудителя симптомов, известны случайные находки данных вирусов при неясных инфекциях ЦНС (менингоэнцефалитах и других инфекционных процессах (Fiala M. Chatturjee S. Ellis R. et al. "Fevir of undetermined origin. Role of cytomegalovirus and Epstein Barrvirus. "West.J. Med. 1978, 129, N 4, p.263-266). Поэтому чрезвычайно важно установление диагноза ДНК-вой инфекции и ее формы, особенно в ребенка.

В настоящее время известно, что главной характеристикой первичной острой вирусной инфекции герпетической группы является образование антител к вирусу в классе Jg M. На этом основаны лабораторные методы выяснения острой первичной инфекции и ее обострения. В то же время известно, что антитела класса Jg-M вырабатываются только при первичном иммунном ответе, повторная иммунизация сопровождается сразу началом синтеза JgG- антител (Петров Р.М. Иммунология, 1982, с. 59). Если считать обострение хронической вирусной инфекции с вторичной вирусной репродукцией аналогичным повторной иммунизации, то очевидно, что определение JgM-антител для доказательства наличия факта обострения недостаточно. Более того, при трансплантации почек первичная ЦМВ-инфекция характеризуется появлением JgG- антител к полипептиду 66000 Д (Lavdini M. P. , Rossier E., Schmitz. "Antibadies to human cytomegalovirus structural polypeptides during infection" J. Virol. Meth, 1988, V. 2, N 2-3, p. 309-317). Показано также что, при инфекции, вызванной вирусом ЭБ, дифференцирование острой инфекции и обострения возможно по различной степени авидности антител класса JgG (низкоавидные при острой инфекции и более авидные при обострении). (Gray Y.Y., Wreghitt T.9. "Immunoglobulin 9 avidity infriction in organ transplant ricipients" Serodiagn and Immunothiraph. Infect Disease. 1989, v.3, N6, p. 389-393). Однако такой метод для диагностики мало пригоден из-за трудности оценки степени авидности.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ выявления цитомегаловирусной инфекции у человека (беременные, иммунодефицитные лица) с помощью определения антител класса JgM к цитомегаловирусу в иммуноферментном твердофазном тесте (Schaefirl, Cesario A., Demmler 9. et al. "Evalution of Abbott CMV-Mensyme immuneassay for detiction of cytomegalovirus immunjglobulin M antibody" J.Clin. Microbiol.-1988.-V.26. N10, p. 2041-2043. Способ основан на сорбции антигена цитомегаловируса на полистироловых шариках. Шарики вносятся в исследуемые сыворотки, после сорбции и соответствующего промывания, на комплекс, полученный на шариках, сорбируют антиглобулин против JgM - человека, меченный пероксидазой хрена. Далее проводится стандартная ферментная реакция с внесением ортофенилендиамина в смеси с H₂O₂, при изменении цветности реакция останавливается IN H₂SO₄ и интенсивность окрашивания измеряется при длине волны 490 нм. По величине показателя оптической плотности оценивают уровень JgM-антител цитомегаловирусу.

Однако в такого рода способе не определяют антитела JgG-класса, и особенно подклассов JgG_1,2,3,4. В то же время известно, что антитела класса JgM образуются только при первичном иммунном ответе (см. выше), а для дифференцировки острой инфекции, хронически-персистирующей ее формы и обострения необходимо определить весь спектр JgG - класса.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для диагностирования различных форм ДНК-вых инфекций проводится определение антител как класса JgM , так и одновременно подклассов JgG-антител (подтипов 1, 2, 3 и 4). Способ основан на том, что свойства всех этих антител различны и их определение возможно без использования специфических моноклональных антител к этим подклассам.

Известно, что дифференцирование подклассов JgG-антител возможно по следующим характеристикам. Антитела подклассов JgG_1-2 легко связываются с белком A стафилококка (штамма Cowau I) и не разрушаются деструкторами дисульфидных связей (цистеином, меркаптоэтанолом), так как имеют полноценный Fc-фрагмент и минимальное число дисульфидных мостиков между H-цепями (2-4). В отличие от этого 3 разрушается цистеином (число-S-S-связей > 10) и не сорбируется на белок A-стафилококка. Антитела JgG₄ в отличие от JgG₃ сорбируются на стафилококк, но не разрушаются цистеином (число S-S-связей в H-цепи 2-3). Очень важно также, что JgG₄ не сорбирует комплемента в нативном состоянии.

Острая инфекция (первично-острая инфекция) характеризуется нарастанием антител класса JgM в крови детей. В части случаев уже в первично взятой сыворотке в нативном ее состоянии определяются высокие уровни антител, которые не сорбируются стафилококком и полностью разрушаются при обработке цистеином. Это также характеризует первично-острую инфекцию. Дополнительным подтверждением первично-острой инфекции является увеличение антител такого же типа в парных сыворотках, взятых у больного с интервалом в 10-14 дней, либо снижение их во второй сыворотке с появлением снижения класса JgG_1-2 (см. ниже). В заявляемом способе постулируется положение, что повторные обострения хронических ДНК-вых инфекций сопровождаются увеличением не антител класса JgM, а JgG ₃. Определение последних осуществляется также с помощью стафилококка и цистеина. При этом уровень антител в нативной сыворотке может быть незначительным, а иногда даже отсутствовать. После обработки сыворотки стафилококком и центрифугирования отмечается повышение в надосадке достоверного уровня антител. Если в нативной сыворотке антитела выявляются в умеренных титрах (1:10 - 1:35), то после обработки стафилококком титр класса JgG₃ не меняется, однако они снижаются после обработки цистеином. Отличие этих антител от класса JgM заключается в значительно большей их концентрации в нативной сыворотке, а также более быстрым разрушением препаратами цистеина.

Хронически-персистирующая форма ДНК-вой инфекции характеризуется появлением у больного антител класса JgG₄. Титр их не бывает высоким, а в части случаев в нативной сыворотке они первично вообще не определяются. Эти антитела отличаются следующими характеристиками: они сорбируются на стафилококк, практически илиминируясь из сыворотки полностью, но в то же время они не разрушаются цистеином, меркаптоэтанолом и другими сульфиддеструктирующими препаратами. Более того, при отсутствии этих антител в нативной сыворотке обработка цистеином может проявлять эти антитела до значительных величин. Связано это с тем, что этот тип антител может связываться друг с другом специфическими антиглобулинами и рядом других белков сыворотки, также содержащих -S-S- связи. При установлении хронически-персистентной инфекции антитела тестируются после обработки стафилококком и цистеином и сорбции их на стафилококк при увеличении титра после обработки цистеином характеризуют персистирующую инфекцию.

Способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе испытуемую сыворотку тестируют на наличие антител к ДНК-вым вирусам - цитомегалии, герпесу, вирусу Эпштейн-Барра в нативных пробах и после укороченной обработки цистеином на наличие антител класса JgM. Нативную сыворотку разводят 1:5 и соединяют в равных объемах с 2% суспензией цистеина. Спустя 1 ч контакта при 37^oC проба центрифугируется при 3000 об/мин - 10 мин и надосадок параллельно с нативной сывороткой соединяется с рабочей дозой (чаще в разведении 1:20) вирусов цитомегалии, герпеса и Эпштейн-Барра. В группе каждого антигена ставятся следующие параллели по 0,1 мл каждого ингредиента: A - контроль нативной сыворотки + вероналовый буфер (без антигена), Б - сыворотка после обработки цистеином + вероналовый буфер (без антигена), B- A + антиген соответствующего ДНК-ового вируса, Г- Б + антиген соответствующего вируса.

К указанным смесям добавляются 2 АЕ комплемента в объеме 0,2 и ставят на контакт при 37^oC в течение часа. После этого в исследуемые материалы добавляют гемолитическую систему, состоящую из равных объемов 0,3% гемолитической сыворотки и 0,5% взвеси бараньих эритроцитов. Опыт выдерживают далее при 37^oC в течение 1 ч, а затем 18 ч при 4^oC для оседания негемолизированных эритроцитов. Надосадок в дальнейшем пересасывают в чистые лунки панелей и добавляют смесь 3% перекиси водорода с 0,1% раствором ортофенилендиамина. Развившуюся цветную реакцию через 30 мин останавливают IN H₂SO₄ и измеряют показатели экстинкции цветности на иммуноферментном анализаторе при длине волны 490 нм. Пересчет титров выявленных антител проводят по стандартной калибровочной кривой.

При резком снижении титров выявленных антител после ускоренной обработки цистеином по сравнению с необработанной нативной сывороткой - выявленные антитела относятся к классу JgM. Если уровень антител не меняется, то проводится второй этап исследований для выявления подклассов антител JgG_1-2, G₃ и G₄.

С этой целью нативная сыворотка вновь обрабатывается цистеином в течение 18 ч при 4^oC и параллельно - 2% суспензией стафилококка (штамма Cowau I). Далее пробы центрифугируются при 3000 об/мин в течение 15-20 мин, надосадок отсасывается и ставятся три параллели- нативная сыворотка, сыворотка после ночной обработки цистеином и сыворотка после сорбции на стафилококк включаются в реакцию с антигенами исследуемых ДНК-вых вирусов (герпесом, цитомегалией, вирусом Эпштейн-Барра). Сыворотки в равных объемах ставятся на контакт с исследуемыми вирусами на 37^oC на 1 ч, параллельно проводят контроли сывороток без вирусных антигенов и антигена вирусов без сывороток. Определение титров антител идет так же, как и на первом этапе исследований.

Оценка подклассов антител проводится следующим образом:
- при снижении титра антител после сорбции на стафилококк антитела относятся к классу JgG₁ и JgG₂,
- при достоверно равных титрах антител в нативной сыворотке и в надосадке после сорбции антител на стафилококк, но при разрушении антител цистелием - антитела относятся к классу JgG₃,
- при отсутствии антител или низких их титрах в нативной сыворотке увеличение показателя антител после обработки цистеином характеризует наличие антител класса JgG₄ .

Такое распределение антител позволяет диагностировать первично-острую ДНК-вую инфекцию по наличию антител класса JgM, обострение хронической инфекции по превалированию антител класса JgG₃ и персистентно-хроническую инфекцию по превалированию антител класса JgG₄.

Пример 1 - острая инфекция
В онкологической клинике наблюдался больной Медведев Д., 6 лет. При обследовании на цитомегаловирусную инфекцию были выявлены следующие антитела. В нативной сыворотке титр анти-ЦМВ-антител составил 1:28. При ускоренной (1 час) обработке цистеином антитела в надосадке не обнаружены (0), после обработки стафилококком титр антител составил 1:26 (табл.1).

Вирусологический диагноз: первично-острая цитомегаловирусная инфекция (антитела класса JgM 1:28).

Пример 2 - обострение хронической инфекции
У онкологической больной Саковой И., 5 лет при обследовании на цитомегалию выявлены следующие титры антител. В нативной сыворотке крови больной титр анти-ЦМВ-антител составил 1:51, после обработки цистеином (ускоренной) титр не изменился - 1:50. После ночной обработки цистеином антитела снизились до 1:26, однако после сорбции на стафилококк титр антител практически не изменялся - 1:46 (табл.2).

Таким образом, у больной обнаружены антитела к цитомегаловирусной инфекции класса JgG₃.

Вирусологический диагноз: обострение хронической цитомегаловирусной инфекции (титр антител JgG₃-класса (1:51-1:26)2=1:25
Пример 3 - хронически-персистирующая инфекция
У больного Семенова К., 6 лет при обследовании на герпетическую инфекцию антител в нативной сыворотке не обнаружена. После ускоренной обработки цистеином антитела также не выявлены. При длительной 18-часовой обработке цистеином в сыворотке появились антитела с титром 1:23. После контакта сыворотки с суспензией стафилококка антитела в надосадке не появились.

Таким образом, у ребенка обнаружены антитела после обработки цистеином, которые относятся к классу JgG₄ (табл.3).

Вирусологический диагноз: хронически-персистирующая герпетическая инфекция (антитела класса JgG₄).

Таким образом заявляемый способ позволяет с помощью оценки уровня различных подклассов иммуноглобулинов JgG к ДНК-вым вирусам установить фазу заболевания, не прибегая к трудоемким методам выделения вирусов, их типирования и доказательства активации хронической или персистентной инфекции.

Обследование более чем 1000 больных, в том числе детей с различной нейтропатологией (менингоэнцефалиты, судорожное состояние, внутриутробные инфекции), беременных женщин, больных гепатитом, а также больных со злокачественными образованиями позволило не только установить диагноз ДНК-вой инфекции, но выявить зависимость между устанавливаемыми нами фазами заболевания и клиническими проявлениями болезни у обследованных.

Так у больных с лимфомами обострение цитомегаловирусной инфекции сопровождалось ухудшением клинического состояния и выявлением заявляемым способом антител к ЦМВ в подклассе JgG₃.

Точно так же фазы персистентной инфекции с выявлением антител подкласса JgG₄ заявляемым способом удавалось обнаружить у новорожденного с легким неврологическим статусом при достоверном доказательстве наличия цитомегаловирусной инфекции у матери.

У детей первого года жизни (135 человек) в 17% случаев диагностировалась активация герпетической инфекции, характеризующаяся стертыми формами менингоэнцефалита. В этом случае в используемом нами тесте четко выявлялось нарастание подклассов антител JgG₃.

Представленные данные по клинико-вирусологическим наблюдениям позволяют утверждать, что заявляемый авторами способ сорологической диагностики ДНК-вых инфекций, основанный на дифференцированном выявлении у больных антител JgM и JgG подклассами JgG_1-2, G₃, JgG₄ достоверен и специфичен.

С помощью этого способа возможно диагностировать различные фазы ДНК-вых хронических инфекций, что может служить основанием для клиницистов в плане тактики проведения специфической и неспецифической терапии, учитывая, что в данной ДНК-вой группе инфекций имеются специфические этнотропные препараты, разрешенные для лечения детей.

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике вирусных инфекций. Способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-вых инфекций у детей, основанный на принципе определения антител подклассов JgM, JgG₁, JgG₂, JgG₃ и JgG₄, дифференцирует их по степени разрушения цистеином и сорбции на стафилококк, и по степени разрушения цистеином и по различному уровню выявляемых антител в этих подклассах диагностируют острую форму инфекции, хроническую и персистирующую. С помощью этого способа можно диагностировать различные фазы ДНК-вых инфекций. 3 табл.

Способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-вых инфекций, отличающийся тем, что дополнительно определяют антитела подклассов JgG₁ - JgG₂ и JgG₃ - JgG₄ дифференцируют их по степени разрушения цистеином и сорбции на стафилококк и при наличии антител класса Jg М диагностируют острую форму, при превалировании антител класса JgG₃ - обострение хронической инфекции и при превалировании антител класса JgG₄ - персистентно-хроническую форму.