СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТЯЖЕЛЫХ ФОРМ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА, ВЫЗВАННОГО ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР, У ДЕТЕЙ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/53 G01N33/536 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике инфекционных заболеваний у детей и взрослых.

Сложность клинической диагностики вызванного вирусом Эпштейна-Барра (ВЭБ) инфекционного мононуклеоза, связанная с полисиндромностью течения заболевания, и трудности ранней дифференциальной диагностики данной инфекции среди групп заболеваний с синдромом тонзиллита и мононуклеозоподобным синдромом резко повышает актуальность лабораторной диагностики этой нозологической формы, особенно при ее тяжелом течении.

Частое сочетание этой инфекции с другими острыми вирусными и бактериальными инфекциями, неоднозначность прогноза перехода первичной инфекции в хроническую форму, наряду со связью ВЭБ с рядом онкологических заболеваний создают особую важность разработки оригинальных лабораторных приемов диагностики данной инфекции.

В настоящее время имеется достаточное число современных высокочувствительных тестов по диагностики инфекции, вызванной ВЭБ, позволяющих достаточно быстро определять АТ или АГ и подтверждать у больного диагноз инфекционного мононуклеоза. К этим методам относятся определение с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и непрямой иммунофлюоресценции Ig A,M,G к вирусному капсидному и раннему АГ-ам ВЭБ (Hadar T., Margalith М., et al. The significance of serum Ig М, Ig A and Ig G antibodies specific for EBV as determined by immunoperoxidase assay in the rapid diagnosis of infectious mononucleosis. Isr-J-Med-Sci. 1995 May; 31(5): p 280-3. Shedd D., Angeloni A., et al. Detection of human serum antibodies to the BFRF3 EBV capsid component by means of a DNA-binding assay. J-Infect-Dis. 1995 Nov; 172(5); p1367-70.). Антигены (белки) ВЭБ (Zebra, протеин EBVA-2 и латентный мембранный протеин (LMP)) выявляют на фиксированных клеточных срезах. Также белки ВЭБ (EBER 1-2, BHLFI и др.) определяют методом гибридизации in situ на отпечатках тканевых срезов (Anagnostopoulos I, Hummel М, et al. Morphology, immunophenotype, and distribution of latently and\or productively EBV-infected cell in acute infectious mononucleosis: implications for the interindividual infection route of EBV.Blood. 1995 Feb 1; 85(3); p 744-50.). С целью определения ДНК ВЭБ в лимфоцитах периферической крови используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Kenagy D.N., Schlesinger Y., et al. EBV DNA in peripheral Blood leukocytes of patients with posttransplant lymphoproliferative disease. Transplantation. 1995 Sep 27; 60(6): 547-54.). Недостатками всех этих методов является следующее. Все перечисленные методы могут оценить патологическую систему только по АГ или AT. Это определяет только одну сторону процесса. Причем AT образуются отсроченно, поэтому в начале инфекционного процесса их может не быть. Методы по определению АГ в мазках, несмотря на высокую специфичность, не могут дать ответа на вопрос о фазе инфекционного процесса, а также сложны в заборе материала. Методы, основанные на ПЦР, пока мало применимы в практическом здравоохранении ввиду высокой себестоимости и высокого числа ложноположительных результатов.

Кроме того, предлагаемыми способами, определяющими вирусные АГ-ны или АТ-ла, не удается определить специфические иммунные комплексы (СИК).

Наиболее близким к предлагаемому способу является "Способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-вых инфекций" (Аксенов О.А., Осипова 3.А. , патент на изобретение N 10121683 от 10 ноября 1998 г.). По прототипному способу определяют в количественной ферментной реакции связывания комплемента AT подклассов Ig М и Ig G 1-2, 3 и 4 и по их соотношению дифференцируют первично острую фазу инфекции, а также повторное обострение и хронизацию процесса. Способ позволяет в течение 12-18 часов дифференцировать эти фазы инфекции. Однако недостатком этого способа является невозможность установления диагноза на этапе отсутствия AT у больного, т.е. на самом раннем этапе инфекции.

Этот недостаток устраняется в предлагаемом способе.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что для прогноза тяжести течения инфекционного мононуклеоза и этиологической диагностики тяжелых форм данной инфекции, когда свободные AT еще не образовались в достаточном количестве, в крови больных определяют специфические иммунные комплексы по увеличению активности экзогенного комплемента (более 0,20 о.е.) при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами или вирусом Эпштейна-Барр и по соотношению комплексов с полным или неполным связыванием антигена дифференцируют тяжелые и легкие формы инфекционного мононуклеоза. С помощью количественной реакции связывания комплемента определяют два вида СИК - комплекс с надостаточной инактивации антигенных детерминант вируса (СИК 1 типа) и комплекс с полной инактивацией, но слабой авидностью связи вирусных антигенов со специфическими ранними AT (СИК 2 типа). СИК 1 типа, отражающий недостаточный иммунный процесс, ведущий к неполной инактивации вируса, менее зависим от длительности инфекционного процесса, а более отражает тяжесть течения заболевания. Поэтому наличие СИК данного типа позволяет прогнозировать большую тяжесть процесса при дальнейшем течении заболевания.

Способ осуществляли следующим образом. Сыворотки обследованных больных соединяли со стандартной антисывороткой к ВЭБ или антигенами вируса Эпштейна-Барр любого происхождения (специально приготовленные или в виде сыворотки больного острого периода, содержащего достоверное количество подтвержденного антигена этого вируса). К таким системам добавляли две дозы стандартного комплемента, а спустя час контакта гемолитическую систему - 0,85% взвесь бараньих эритроцитов и 10 доз антисыворотки к ней. Учет опыта проводили по наступлению гемолиза в контролях исследуемой сыворотки без внесения специфических антител или вирусных антигенов с помощью количественного выявления оксидазных ферментов в реакции с 0,1% раствором ортофенилендиамином и перекисью водорода. Реакцию останавливали 1 N H₂SO₄. Количество фермента оценивали на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01C при длине волны 492 нм. Активность СИК-1 рассчитывали в опыте с внесением специфических антител на первом этапе: а СИК-2 в опыте с внесением антигена ВЭБ по формуле
СИК (1,2)=(Кк-Коп)/Кк,
где Кк- количественный показатель ферментов в контроле исследуемой сыворотки, Коп - то же в опытной пробе.

При расчете этой формулы за минимальное содержание СИК принимали величину > 0,10.

При стандартной постановке реакции связывания комплемента для определения свободных антител или антигенов концентрация свободных белков комплемента резко снижается, что показывает наличие указанных ингредиентов в исследуемой жидкости. Предлагаемый в заявляемом способе метод определения специфических иммунных комплексов основан на противоположном результате - увеличении активности комплемента по сравнению с контролями после добавления к исследуемой пробе специфических антител или антигенов и низкой дозы экзогенного комплемента. Это усиление основано на феномене расщепления уже имеющегося в пробе раннего иммунного комплекса при внесении более овидных антител или большой концентрации антигена.

В этом случае при перемешении антител на вновь вносимые ингредиенты эндогенный комплемент, находящийся в специфическом иммунном комплексе, выходит в раствор в форме отдельных белков системы комплемента, что выявляется по увеличению гемолиза при постановке способа. Если в пробу вносились высокоовидные антитела, то усиление комплементарной активности соответствовало содержанию в ней СИК-1 - комплекса с неполной инактивацией вируса с превалированием АГ над АТ-ными эпитопами вируса. При внесении в исследуемую пробу АГ-ов вируса ВЭБ в значительной концентрации усиление комплементарной активности соответствовало наличию СИК-2 - комплекса с превалированием AT над АГ-нами.

Т.к. известно, что свободные AT появляются достаточно поздно, совершенно очевидно, что на раннем этапе инфекционного мононуклеоза в свободной циркуляции в кровяном русле первыми должны быть специфические иммунные комплексы. Учитывая длительный инкубационный период (3-7 недель), очевидно, что в первые дни заболевания при благоприятном течении процесса в крови должны циркулировать СИК-2 - комплексы с полной инактивацией вируса и полным насыщением антителами. При неблагоприятном течении процесса этого быть не должно и комплекс должен относиться к типу СИК-1, где антигенные детерминанты вируса не полностью закрыты АТ-ми и неинактивированные антигенные эпитопы отчетливо преобладают над AT.

С другой стороны, при большой концентрации иммунных комплексов (СИК-2), выявляемой в данном способе по величине усиления активности комплемента, клиническое течение заболевания также может быть достаточно тяжелым в связи с невозможностью организма полноценно элиминировать такое большое количество комплексов -СИК. Т. о. , степень клинических проявлений зависит от качественного состава специфического иммунного комплекса и его количественной характеристики.

Заявляемый способ позволяет с достаточной степенью вероятности проводить прогноз течения инфекционного мононуклеоза. Более тяжелые случаи развиваются при тестировании в крови больных СИК -1 > 0,10 о.е. или СИК-2 > 0,2. При таких показателях у больных тяжесть состояния связана с большей выраженностью симптомов интоксикации, проявляющихся более длительное время (табл. 1 и 2). У этих больных имеет место большая длительность гипертермии. При указанных показателях выявляются большие величины гепато- и спленомегалии, как отражение характерного для инфекционного мононуклеоза лимфорпролиферативного синдрома. Длительность интоксикации составляла 4,7-4,9 дня, температуры - 4,9-6,2, увеличение печени достигало 1,36-2,3 см ниже реберной дуги, а селезенки - 0,21-0,89 см ниже реберной дуги.

Доказательством истинности предлагаемого способа в отношении определения прогноза течения ИМ явилось подтверждение этого положения посредством определения у больных количества атипичных мононуклеаров крови, характеризующих тяжесть инфекционного процесса при данной инфекции, и уровня α - ИФ сыворотки, являющегося основным ингибитором репродукции вируса. Для больных из группы с тестированием AT без иммунных комплексов характерны низкие показатели атипичных мононуклеаров - 0,28-0,53х10х6, а при наличие комплексов особенно СИК-1 эти показатели составили 1,36-1,67х10х6. Концентрация α-ИФ при более тяжелых формах и определении СИК-1 и СИК-2 (> 0,2) была минимальна-3,9-4,5 МЕ/мл крови, а при наличие свободных AT она была достоверно выше -5,1-12,2 МЕ/мл.

Таким образом выявление при инфекционном мононуклеозе специфических иммунных комплексов типа СИК-1 с превалированием АГ, а также циркуляция в крови СИК-2 в высокой концентрации означает недостаточный иммунный ответ, заключающийся либо в пониженной антителообразующей активности плазмоцитов, либо в сниженной способности фагоцитов захватывать и удалять нормально образующиеся иммунные комплексы. Блокада плазмоцитов связана с инфицированием их предшественников - В-лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр. Блокада фагоцитов связана с повышенной концентрацией основного противовоспалительного лимфокина ИЛ-10, характерной для данной инфекции. Все это естественно ведет к утяжелению клинической картины инфекционного мононуклеоза.

Клинические примеры. Пример 1.

Розова Елена 14 лет поступила на 4 день остро начавшегося заболевания с д-зом: Дифтерия зева? Инфекционный мононуклеоз. При поступлении состояние средней тяжести, вялая, жалуется на боли в горле. Температура - 39,0. Носовое дыхание сохранено. В зеве пленчатые желтоватые налеты, за пределы миндалин не распространяются. Верхнепереднешейные лимфатические узлы до 2 см, заднешейные - до 1,5 см, без отека над ними. Живот мягкий, безболезненный. Печень пальпируется на 1 см ниже реберной дуги, селезенка не увеличена. В клиническом анализе крови при поступлении атипичные мононуклеары составляют 8% от лейкоцитов крови. Уровень гетерофильных AT в реакции Пауль-Буннеля - 1/16. Уровень СИК ВЭБ 2 типа - 0,12.

В дальнейшем общая длительность температуры составила 3 дня, симптомы интоксикации сохранялись 4 дня. Размеры печени нормализовались через 3 дня и девочка была выписана с выздоровлением на 12 день болезни.

Пример 2. Лебедев Артем, 7 лет поступил на 6 день остро начавшегося заболевания с диагнозом - эпидемический паротит. При поступлении состояние тяжелое, вялый. Отмечается пастозность лица. Температура 38,5. Носовое дыхание резко затруднено. Зев гиперемирован, миндалины увеличены до III степени, на миндалинах единичные точечные белые налеты. Передне- и заднешейные лимфатические узлы спаяны в пакеты. Печень увеличена до 6 см ниже реберной дуги, селезенка увеличена до 10 см ниже реберной дуги. В клиническом анализе крови атипичные мононуклеары составляли 44% лейкоцитов. Гетерофильные AT в реакции Пауль-Буннеля составили 1/128. Уровень СИК 2 типа -0,15.

В дальнейшем общая длительность температуры составила 10 дней, симптомы интоксикации сохранялись 12 дней. К выписке на 25 день болезни печень пальпировалась на 2 см ниже реберной дуги, селезенка на 5 см ниже реберной дуги. Ребенок был выписан с улучшением под наблюдение районной поликлиники.

Заявляемый способ был опробирован на 170 больных с первичным инфекционным мононуклеозом. При постановке способа (СИК-1 + СИК-2 > 0,2) спрогнозировано 34% тяжелых форм инфекционного мононуклеоза. При окончательной выписке больных из стационара тяжелые формы составили 32% (p< 0,001).

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа диагностики тяжелых форм инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барра у детей. Способ включает в себя определение специфических иммунных комплексов с данным ДНК-содержащим вирусом по увеличению активности экзогенного комплемента при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами (СИК-1) или вирусом Эпштейна-Барра (СИК-2) с дальнейшим расчетом активности иммунных комплексов по формуле и дифференцируют тяжелые формы от легких по наличию в крови специфических иммунных комплексов по коэффициенту СИК-1 или СИК-2. 2 табл.

Способ диагностики тяжелых форм инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барра, у детей путем определения иммунных комплексов, отличающийся тем, что в крови больных определяют специфические иммунные комплексы с данным ДНК-содержащим вирусом по увеличению активности экзогенного комплемента при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами (СИК-1) или вирусом Эпштейна-Барра (СИК-2) с дальнейшим расчетом активности иммунных комплексов по формуле
СИК (1,2) = (К_к-К_оп)_хК_к,
где К_к - количественный показатель фермента в контроле исследуемой сыворотки;
К_оп - то же в опытной пробе,
и дифференцируют тяжелые от легких форм инфекционного мононуклеоза по наличию в крови специфических иммунных комплексов СИК-1 более 0,10 относительных единиц или СИК-2 более 0,20 относительных единиц.