СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА Российский патент 1995 года по МПК C12N9/64 C12N9/50 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения протеолитических ферментов, и может быть применено для получения очищенных протеолитических ферментов для использования в микробиологической промышленности, в сельском хозяйстве, парфюмерии и медицине.

Цель изобретения разработка новых способов получения протеолитических ферментов без использования растворителей и расширение сырьевой базы.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

В качестве сырья используют панкреассодержащие органы рыб: пилорические придатки терпуга, камбалы, трески, сельди, скумбрии, ставриды, мойвы, палтуса, сайры, анчоуса, лососей, гепатопанкреас краба, криля, кальмара, поджелудочную железу морских ластоногих и китообразных, а также крупного и мелкого рогатого скота, свиней, оленей, кур.

Сырье измельчают (гомогенизируют), экстрагируют раствором 1 мМ хлористого кальция, добавляют 0,2% детергента, гомогенат очищают от крупно- и мелкодисперсных взвесей сапарированием, суперцентрифугированием и микрофильтрацией.

Ультрафильтрацию проводят на половолоконных или других мембранах с размером пор 15000-20000 Да. После этого раствор, содержащий протеолитический комплекс, сушат сублимационной или распылительной сушкой.

Полученный продукт (протеолитический комплекс) представляет собой аморфный порошок (от светлого до темно-коричневого цвета) растворимый в воде, содержащий щелочные, нейтральные и кислые протеазы: трипсин, химотрипсин, коллагеназу.

П р и м е р 1. 1 кг пилорических придатков окуня-терпуга измельчают, экстрагируют добавлением 2 объемов 1 мМ раствора хлористого кальция и 2% додецилсульфата натрия, выдерживают 16 ч при 6^оС. Все последующие операции проводят при этой же температуре. Затем проводят сепарирование для отделения крупнодисперсных фракций соединительной ткани на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость направляют на осветление, проводимое на суперцентрифугах при 15000 об/мин, и на микрофильтрацию, проводимую на установках мембранной фильтрации с размерами пор в мембранах 200 мкм.

Полученный раствор пропускают через установку с половолоконными мембранами, имеющими размер пор 20000 Да. Концентрирование проводят до уменьшения объема исходного раствора в 10 раз. Раствор сушат на распылительной установке при температуре в зоне распыления 75^оС.

Выход сухого продукта 12 г. Активность ферментов: щелочные протеазы (рН 8,0; субстрат казеин) 82 Е/г, нейтральные протеазы (рН 6,0; субстрат-гемоглобин) 7 Е/г, кислые протеазы (субстрат-гемоглобин) 5 Е/г.

П р и м е р 2. 1 кг пилорических придатков камбалы измельчают, экстрагируют в 2 объемах 1 мМ раствора хлористого кальция, добавляют 0,2% додецилсульфата натрия для разрушения межмолекулярных комплексов. Выдерживают 24 ч при 4^оС. Проводят разделение сепарированием на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин, надосадочную жидкость направляют на дальнейшее разделение от липидной фракции и мелкодисперсных частиц последовательно на суперцентрифуге при 13000 об/мин и установке мембранной фильтрации с размером пор в мембране 200 мкм.

Полученный раствор направляют на ультрафильтрацию, проводимую на половолоконных фильтрах с размером пор 15000 Да. Концентрирование проводят до уменьшения объема исходного раствора в 12 раз.

Очищенный раствор сушат на распылительной установке. Выход сухого продукта 14 г активностью, Е/г: Щелочные протеазы 48 Нейтральные протеазы 12 Кислые протеазы 4
П р и м е р 3. 1 кг пилорических придатков лососей гомогенизируют, добавляют 2 л 1 мМ раствора хлористого кальция и 6 г додецилсульфата натрия, оставляют при перемешивании на 24 ч. Затем проводят сепарирование для отделения крупных фракций соединительной ткани на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость направляют на осветвление, его проводят на суперцентрифугах при 13000-15000 об/мин. Затем проводят очистку от мелкодисперсных частиц на установках мембранной фильтрации с размерами пор в мембранах 200 мкм.

Полученный раствор пропускают через установку с поволоконными мембранами, имеющими размер пор 20000 Да.

Концентрирование проводят до 10-кратного уменьшения исходного объема.

Так как препарат предназначается для лечебных целей, то полученный раствор направляют на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы и сушат сублимационным способом. Выход конечного продукта 36 г с активностью протеаз, Е/г: Щелочные 390 Нейтральные 31 Кислые 12 и эстеразной активностью: трипсина (субстрат ТАМЭ-N-тозил-L-аргинин метиловый эфир) 627 Е/мг, химотрипсин (субстрат БТЭЭ-N-бензоил-L-тирозин этиловый эфир) 2090 Е/мг
П р и м е р 4. 1 кг гепатопанкреаса краба гомогенизируют до однородного состояния, добавляют 2 л 1 мМ раствора хлористого кальция и 6 г додецилсульфата натрия, выдерживают 12 ч. Проводят сепарирование на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Полученный осадок выбрасывают, а 2,4 л надосадочной жидкости центрифугируют на проточной суперцентрифуге при 13000-15000 об/мин, при этом удаляется часть липидной фракции. Очистку от мелкодисперсных частиц осуществляют методом микрофильтрации на мембранах с диаметром пор 200 мкм. Концентрирование 1,9 л полученного раствора проводят на половолоконных ультрафильтрационных аппаратах с мембранами, имеющими диметр пор 15000 Да. Концентрирование проводят до сокращения объема исходного раствора в 10 раз 0,190 л. Полученный концентрированный раствор после стерильной фильтрации разливают во флаконы и сушат сублимационно.

Выход сухого продукта 98 г с активностью протеаз, Е/г: Щелочные 288 Нейтральные 265 Кислые 72 эстеразной активностью: трипсиноподобных ферментов (по субстрату ТАМЭ -N-тозил-L-аргинин метиловому эфиру) 1640 Е/мг; химотрипсиноподобных ферментов (по субстрату БТЭЭ N-бензоил-L-тирозин этиловому эфиру) 714 Е/мг; коллагеназная активность по кислоторастворимому коллагену 672 E/мг.

П р и м е р 5. В качестве сырья используют поджелудочную железу моржа в количестве 500 г.

Получение протеолитического комплекса проводят как в примере 4.

Выход 16% Активность протеаз, Е/г: Щелочные 540 Нейтральные 108 Кислые 21
П р и м е р 6. 1,4 кг поджелудочной железы крупного рогатого скота измельчают, гомогенизируют до однородного состояния, добавляют 2,8 л мМ раствора хлористого кальция и добавляют 0,2% детергента "Бридж 35" (полиоксиэтилен лауриловый эфир), выдерживают 16 ч. Затем проводят сепарирование на горизонтальной осадительной центрифуге при 3500 об/мин. Осадок выбрасывают, а надосадочную жидкость разделяют на проточной суперцентрифуге при 13000-15000 об/мин, при этом удаляется и отбрасывается липидная фракция. Очистку от мелкодисперсных частиц проводят методом микрофильтрации на мембранах с размером пор 200 мкм. Затем раствор подается на ультрафильтрацию, проводимую на кассетных установках. Задерживающая способность мембран распространяется на молекулы массой 20000 Да.

Сушку очищаемого раствора проводили методом сублимации.

Выход сухого продукта 53 г с активностью: Щелочные протеазы, Е/г 440 Нейтральные протеазы, Е/г 156 Кислые протеазы следовое
количество Трипсин (субстрат ТАМЭ), Е/мг 7625 Химотрипсин (субстрат АТЭЭ ацетил-тирозин этиловый эфир), Е/мг 5059
П р и м е р 7. В качестве сырья используют поджелудочную железу кур в количестве 300 г. Получение проводят как в примере 6.

Выход конечного продукта 12 г с активностью: Щелочные протеазы, Е/г 204 Нейтральные протеазы, Е/г 14 Кислые протеазы, Е/г 9 Трипсин (субстрат ТАМЭ), Е/мг 1680 Химотрипсин (субстрат АТЭЭ), Е/мг 1025

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ включает измельчение панкреассодержащих органов наземных или водных животных, экстракцию протеолитического комплекса 1-ным раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента. Затем экстракт центрифугируют, а супернатант подвергают микрофильтрации. Протеолитический комплекс выделяют путем ультрафильтрации через мембраны с задерживающей способностью 15000 - 20000 Да.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, предусматривающий гомогенизацию исходного сырья, очистку его отделением примесей, выделение и сушку, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют панкреассодержащие органы наземных и морских животных, осуществляют экстракцию протеолитического комплекса, из гомогената 1 мМ раствором хлористого кальция, содержащим 0,2% детергента, при этом очистку от примесей проводят ступенчатым центрифугированием и микрофильтрацией, а выделение комплекса - ультрафильтрацией через мембраны с задерживающей способностью по мол. м. 15000 20000.